玫瑰花瓣總黃酮和總多糖的體外抗氧化活性

帕爾哈提·柔孜，阿依姑麗·艾合麥提*，朱 昆，劉 璐，胡 月，何文婷

(新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

自由基與許多病理生理現象都有密切的關系，如衰老、腫瘤、炎癥、突變、心腦缺血、動脈粥樣硬化、帕金森病等[1-3]。抗氧化劑的抗氧化作用可以通過抑制自由基的產生，或直接清除自由基，甚至可以通過提高內源性抗氧化物質的水平來實現。因而體內維持一定水平的抗氧化劑，可延長壽命和推遲衰老。外加一些抗氧化劑協助體內維持氧代謝的平衡，對于防止疾病的發生和保持機體的健康是十分有益的。因此從天然產物中尋找高效、價廉、低毒具有抗氧化、清除自由基功能的化合物的研究工作就變得十分重要[4-5]。

和田玫瑰又名粉玫瑰，由于和田特殊的地理氣候環境，使得和田玫瑰花瓣期長，花瓣朵大出油率高，是不可多得的優良品種。和田玫瑰具滋補腸胃、改善消化、芳香開竅、安神止痛、軟腸通便、潤膚生輝等[6]多種效果。維吾爾民間常將玫瑰花醬用于胸脅胃脘脹痛以及消化不良、月經不調等癥，玫瑰花瓣常用于泡茶，進行全身玫瑰浴。目前，對和田玫瑰的研究主要限于玫瑰紅色素的提取[7]、玫瑰花醬[8]和玫瑰花茶的制作及應用上，對和田玫瑰花瓣的化學成分以及營養成分與抗氧化方面的研究在國內少見報到。本實驗通過提取玫瑰花瓣中的總黃酮類和總多糖成分，研究其體外的抗氧化活性，以期為和田玫瑰的綜合開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

玫瑰花瓣2011年6月采自于新疆和田地區墨玉縣，憑證標本存于新疆農業大學食品科學與藥學院生藥實驗室。

雄性昆明系小鼠，體質量(20±2)g，購自新疆醫科大學實驗動物中心。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；蘆丁 中國藥品生物制品檢定所提供；葡萄糖、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、硫酸亞鐵、雙氧水、鄰苯三酚、乙醇、三氯化鋁、濃硫酸、水楊酸、苯酚均為國產分析純。

UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；HH-4恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；BT 25S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒實驗儀器有限公司；精密pH儀 上海精科雷磁儀器廠；RE-52型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 玫瑰花瓣總黃酮的提取[9]

準確稱取玫瑰花瓣粉末10g，用75%的乙醇以料液比1：15在室溫下用超聲波提取，提取時間40min，減壓回收乙醇，在烘箱中60℃干燥，即得玫瑰花瓣總黃酮，并測定其提取率，按式(1)計算。

1.2.2 玫瑰花瓣總多糖的提取[10]

準確稱取玫瑰花瓣干粉末10g，用蒸餾水以料液比1：15(m/V)，過夜浸提，在室溫下用超聲波提取，提取時間1h，過濾，濾液減壓濃縮到原來體積的1/5倍，加入5倍量的無水乙醇混合放置過夜，抽濾后的沉淀用100mL水溶解重復醇沉1次。過濾沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，在烘箱中60℃烘干，即得玫瑰花瓣總多糖，并測定其提取率，按式(2)計算。

1.2.3 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖的含量測定

總黃酮含量的測定采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[11]，標準曲線為y=13.4x+0.0548(R2=0.9999)，其中：x為吸光度，y為提取液中總黃酮質量濃度/(mg/mL)，檢測波長510nm，以蘆丁來計算，并測定其相對含量，相對含量按式(3)計算。

式中：c為根據標準曲線計算的黃酮含量/mg；N為稀釋倍數；m為總黃酮提取物的質量/g。

總多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[12]，標準曲線為y=12.919x＋0.0488(R2=0.9982)，其中：x為總多糖質量濃度/(mg/mL)，y為吸光度，檢測波長490nm，以葡萄糖來計算，并測定其相對含量，相對含量按式(4)計算。

式中：c為根據標準曲線計算的總多糖含量/mg；N為稀釋倍數；m為總多糖提取物的質量/g。

1.2.4 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖抗氧化活性的測定

1.2.4.1 對·OH清除率測定

利用Fenton反應體系產生·OH[13]，依次加入6mmol/L FeSO4溶液、6mmol/L 水楊酸溶液各2mL，分別加入2mL不同質量濃度的玫瑰花總黃酮(25、50、100、150、200、250μg/mL)和總多糖溶液(25、50、100、150、200、250μg/mL)，最后加入6mmol/L的H2O2溶液2mL啟動反應，靜置30min后于波長510nm處測其吸光度，以蒸餾水代替樣品溶液做空白，并以同質量濃度的VC作陽性對照，·OH清除率按式(5)計算。

式中：A0為空白吸光度；Ax為樣品吸光度。

1.2.4.3 對DPPH自由基清除率的測定

利用DPPH無水乙醇溶液在波長517nm處紫色團的特定吸收峰[15]，測定加抗氧化劑后，在波長517nm處吸光度的下降表示其對DPPH自由基的清除能力。

具塞試管中加入2mL 2×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液，再分別加入2mL不同質量濃度的總黃酮、總多糖、VC的無水乙醇溶液，混均，在室溫下30min后，于波長517nm處測吸光度AI，同時測定2mL 2×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液與2mL 50%乙醇混合液的吸光度A0，取2mL不同質量濃度的總黃酮、總多糖，VC與50%乙醇混合液測定吸光度AJ。DPPH自由基的清除率按式(7)計算。

1.2.4.4 對小鼠肝自發生脂質過氧化能力測定

利用硫代巴比妥酸法[16]，小鼠禁食12h后處死，取肝，在0～4℃條件下用生理鹽水制成5%肝勻漿。實驗分為對照組(肝勻漿和蒸餾水)、陽性組(肝勻漿和VC)、6個不同劑量的玫瑰花瓣總黃酮組(肝勻漿和總黃酮)和6個不同劑量的玫瑰花瓣總多糖組(肝勻漿和總多糖)。先在各管中分別加入肝勻漿1.0mL，然后在6個劑量組中分別加入(0.1、0.5、1、2、4、8mg/mL)提取物0.1mL，對照組加入蒸餾水0.1mL，陽性組加1mg/mL VC 0.1mL。將各組37℃水浴反應60min(振蕩)，取出，將試管流水冷卻，向各試管加入20%三氯醋酸(TCA)1mL，0.67%硫代巴比妥酸(TBA)1mL，混勻，沸水浴15min(振蕩)取出流水冷卻。然后3000r/min離心，取上清液在波長532nm處測吸光度，并計算抑制率。每組實驗均設5個平行管，實驗重復2次。抑制過氧化能力按式(8)計算。

式中：A0為空白吸光度；Ax為樣品吸光度。

1.2.5 統計分析

2 結果與分析

2.1 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖含量測定結果

表 1 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖的含量Table 1 Contents of total flavonoids and total polysaccharides in rose petals

由表1可知，玫瑰花瓣中總黃酮和總多糖的提取率分別為52.1%、73.3%，含量分別為3.45、5.22mg/mL，制備物中總黃酮和總多糖的相對含量分別為51.75、78.30mg/g。

2.2 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對·OH的清除作用

由圖1可知，玫瑰花總黃酮和總多糖隨著質量濃度的增加，清除·OH的能力不斷提高。根據清除率與質量濃度的線性關系：總黃酮為y=11.325x+25.001(R2=0.9935)，總多糖為y=12.385x+15.594(R2=0.9951)；VC為y=10.038x+23.955(R2=0.9946)；通過線性方程計算得出總黃酮、總多糖及VC的IC50分別為2.21、2.78、2.59μg/mL 。其中總黃酮對·OH的清除能力較VC為強，由此可見，玫瑰花瓣總黃酮和總多糖有較好的清除·OH能力。

圖 1 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對·OH的清除作用Fig.1 Scavenging activities of total flavonoids and total polysaccharides from rose petals on hydroxyl free radicals

2.3 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對O2ˉ·的清除作用

圖 2 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對·的清除作用Fig.2 Scavenging activities of total flavonoids and total polysaccharides from rose petals on superoxide anion free radicals

2.4 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對DPPH自由基的清除作用

圖 3 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activities of total flavonoids and total polysaccharides from rose petals on DPPH free radicals

由圖3 可知，玫瑰花總黃酮和總多糖隨著質量濃度的增加，清除D P P H 自由基的能力不斷提高。根據清除率與質量濃度的線性關系：總黃酮為y=1 2.7 7 5 x ＋2 5.7 5 5(R2=0.9 8 8 5)；總多糖為y=13.371x＋4.0113(R2=0.9933)；VC為y=10.849x＋25.755(R2=0.9885)，通過線性方程計算得出總黃酮、總多糖及VC的IC50分別為2.54、3.44、2.24μg/mL。其中總多糖清除DPPH自由基能力較VC略強，由此可見，玫瑰花瓣不同提取部位物有較好的清除DPPH自由基能力。

2.5 玫瑰花瓣總黃酮和總多糖抑制脂質過氧化的作用

表 2 玫瑰花瓣總黃酮對脂質過氧化的抑制率Table 2 Anti-lipid peroxidation activity of total flavonoids from rose petals

由表2可知，玫瑰花瓣總黃酮對小鼠肝自發性脂質過氧化產物丙二醛(MDA)的生成有一定的抑制作用，且抑制率與質量濃度呈現量效關系，玫瑰花瓣總黃酮的2、4、8mg/mL組與VC組相比能極顯著抑制小鼠肝自發性脂質過氧化過程(P＜0.01)。

表 3 玫瑰花瓣總多糖對脂質過氧化的抑制率Table 3 Anti-lipid peroxidation activity of total polysaccharides from rose petals

由表3可知，玫瑰花瓣總多糖對小鼠肝自發性脂質過氧化產物MDA的生成有一定的抑制作用，且抑制率與質量濃度呈現量效關系，玫瑰花瓣總多糖的0.5、1、2、4、8mg/mL組與VC組相比能極顯著抑制小鼠肝自發性脂質過氧化過程(P＜0.01)。

3 結 論

玫瑰花總黃酮和總多糖具有較強的抗氧化性能，并且隨著質量濃度的增加，其抗氧化性能亦不斷增強，呈現了良好的量效關系。總黃酮清除自由基的能力均強于總多糖，但是總黃酮抑制脂質過氧化作用卻弱于總多糖。有關和田玫瑰花不同部位提取物的抗氧化作用，值得進行進一步研究。

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