馬面魚骨膠原多肽的理化特性及其抗氧化活性

楊 露，丁利君*，藍德安

(1.廣東工業大學輕工化工學院，廣東 廣州 510006；2.廣州市華琪生物科技有限公司，廣東 廣州 510220)

馬面魚，學名叫綠鰭馬面鲀(Navodon septentionalis)，屬鲀形目單角鲀科馬面鲀屬魚類[1]。1994年韓陽等[2]研究馬面魚油與魚肉對老年高血壓有明顯的降血壓作用，并無副作用。2000年陳丕茂等[3]分析了對綠鰭馬面捕撈強度和開捕時間。2010年溫海深等[4]研究了綠鰭馬面鲀的繁殖與發育情況，為其繁殖與養殖提供了科學依據。

市場上由馬面魚加工而成的魚糜、熟食、干制和罐頭等多種食品，日漸被大眾所接受和喜愛。魚骨中蛋白質90%為膠原、骨膠原及軟骨素(酸性黏多糖)，有增強皮下細胞代謝，延緩衰老的作用[5]。利用生物工程得到活性的骨膠原多肽能夠促進人體新陳代謝，具有健脾胃、改善睡眠、延緩衰老、預防骨質疏松作用[5]。膠原多肽以相對分子質量小[6]、易吸收、抗氧化活性強[7]等特點受到高度重視，在醫藥、化妝品、保健品和食品與飼料添加劑等方面有廣闊前景[8]。將生產加工而產生的大量馬面魚骨制成生物活性多肽，能實現“魚盡其用”，變廢為寶，變低值為高值，達到提高經濟價值、增加社會和經濟效益的目的。

本實驗主要探討用生物酶工程技術與響應面法制備的馬面魚骨膠原多肽的基本理化特性及抗氧化功能性，為馬面魚骨的深入開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮馬面魚魚骨，由北海味萊鮮海洋生物科技有限公司提供。

風味蛋白酶(酶活力3×104U/g) 廣州市華琪生物科技有限公司；L-羥脯氨酸標準品 北京奇華盛生物技術發展中心；還原型谷胱甘肽標準品 北京普博欣生物科技有限公司；其他化學試劑均為分析純級。

自動凱式定氮分析儀 上海纖檢儀器有限公司；LGJ-12冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Waters 510高效液相色譜 美國Waters公司；Ultraflex III型基質輔助激光解吸附飛行時間質譜法(MALDI-TOF) 德國Bruker公司。

1.2 馬面魚骨膠原多肽的制備工藝

馬面魚骨洗凈→粉碎→高壓蒸煮→磨漿→生物酶解→初濾去渣→微濾→超濾→冷凍干燥→馬面魚骨多肽粉

1.3 馬面魚骨基本成分分析

水分測定：參照GB/T 13101—1991《西式蒸煮、煙熏火腿衛生標準》方法；灰分含量測定：參照GB/T 24872—2010《糧食檢驗 小麥粉灰分含量測定》方法；總氮含量測定：凱氏定氮法；粗脂肪含量測定：GB/T 5512—1985《糧食、油料檢驗 粗脂肪測定法》方法；水解度測定：游離氨基態氮甲醛快速滴定法[9]；氨基酸的測定：高效液相色譜分析法。

1.4 馬面魚骨多肽液的功能性檢測分析

1.4.1 紫外吸收檢測分析

吸取馬面魚骨粗膠原多肽液，加入蒸餾水，稀釋10倍。以蒸餾水作參比，采用UV-2450紫外-可見分光光度計從波長190～400nm掃描，測定最大吸收峰[10]。

1.4.2 氨基酸組成分析

樣品液中游離氨基酸組成采用高效液相色譜HPLC分析，總氨基酸組成參照劉艷[11]、Morre[12]等的方法將樣品液酸解后采用HPLC分析。氨基酸色譜檢測條件：PICO.TAG氨基酸分析柱，溫度38℃，流速1mL/min，檢測波長254nm。

1.4.3 質譜分析

采用MALDI-TOF質譜法。將樣品配制到一定的質量濃度與基質α-4-氰羥肉桂酸(HCCA)混合均勻，點樣，用質譜儀進行分子質量檢測[13]。

1.5 抗氧化功能分析方法

1.5.1 還原力的測定方法

參考張強[14]、曹煒[15]等的方法測定膠原多肽的還原能力。

1.5.2 清除·OH的測定方法

參考張璟等[16]的方法測定對·OH的清除率。

1.5.3 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的測定方法

參考Xie Zhengjun等[17]的方法，分析魚骨膠原多肽對DPPH自由基的清除效果。

2 結果與分析

2.1 馬面魚骨粉的基本成分分析

表 1 馬面魚骨粉的基本成分Table 1 Proximate analysis of N. septentionalis bone

新鮮馬面魚骨中水分達到70.83%，將其脫水干燥，制得馬面魚骨干粉。由表1可知，馬面魚骨干粉的蛋白質含量高達53.71%，灰分含量高達39.79%。馬面魚骨屬于軟骨類，其中含有豐富的軟骨素及膠原蛋白質，適宜應用到化妝品類產品的開發與研制。

2.2 馬面魚骨膠原多肽粉的氨基酸分析

表 2 馬面魚骨粗膠原多肽的氨基酸成分Table 2 Amino acid composition of collagen from N. ptentionalis bone

采用高效液相色譜分析方法，分析馬面魚骨酶解、分離、干燥后制備的膠原多肽粉的氨基酸組成。由表2可知，馬面魚骨膠原多肽粉中總氨基酸含量達到77.42%，亞氨基酸中的羥脯氨酸和脯氨酸占總氨基酸成分的含量分別為2.66%和6.50%，馬面魚骨多肽粉的氨基酸組成與豬皮、牦牛骨[18]膠原多肽的氨基酸組成相似。馬面魚骨膠原多肽中還含有豐富的甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、賴氨酸，攝入此類多肽，能夠保證氨基酸的營養均衡，粗膠原多肽具有較高的營養價值和保健功能。

2.3 馬面魚骨膠原多肽的紫外吸收光譜

圖 1 馬面魚骨膠原多肽的紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectrum of collagen peptide from N. septentionalis bone

將馬面魚骨膠原多肽樣品，經過UV-2450紫外-可見分光光度計掃描，確定其最大吸收峰。圖1結果表明，其峰值在230nm左右，而在280nm處基本無吸收。這是因膠原蛋白只含有少量的芳香族氨基酸，而膠原蛋白被水解后得到的膠原肽鏈中含有的C—O、—COOH、CO—NH2都是生色基團，可以在220nm附近產生大的光吸收。所提取的膠原蛋白的最大吸收波長約220nm，這與曾少葵等[10]研究的羅非魚鱗膠原蛋白的吸收特征相一致，符合膠原蛋白的特征吸收。

2.4 馬面魚骨膠原多肽的質譜分析結果

采用MALDI-TOF質譜法測定樣品膠原蛋白多肽的分子質量分布范圍，結果如圖2所示，膠原多肽的分子質量分布在3kD以內，集中于1～2kD。因此說明膠原多肽的酶解效果較好，并且與蔣哲等[19]的鯊魚皮膠原蛋白肽的分子質量分布比較接近，此方法對多肽分子質量的測定及分布具有指導意義。

圖 2 膠原蛋白多肽的質譜分析圖Fig.2 Mass spectrum of collagen peptide from N. septentionalis bone

2.5 馬面魚骨酶解液的抗氧化結果

2.5.1 馬面魚骨多肽液的還原力

圖 3 魚骨多肽與谷胱甘肽的還原力比較Fig.3 Reducing power of collagen peptide from N. septentionalis bone and GSH

由圖3可知，隨著膠原多肽質量濃度的增加，還原力不斷上升。在60mg/mL時，魚骨膠原多肽的還原力明顯低于谷胱甘肽；但隨著質量濃度繼續增加，還原力遠遠超過谷胱甘肽。從整體趨勢分析，吸光度越大，膠原多肽還原力越大；質量濃度越高，還原力越強，抗氧化能力越強[20]。此多肽具有良好的抗氧化功能，通過增加使用量能超過99%純谷胱甘肽的抗氧化效果，具有明顯的開發價值。

2.5.2 馬面魚骨膠原多肽酶解液對·OH的清除作用

圖 4 魚骨多肽與谷胱甘肽對·OH的清除作用比較Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of collagen peptid from N. septentionalis bone in comparsion with that of GSH

由圖4可知，魚骨多肽在高質量濃度條件下和谷胱甘肽相比，對·OH的清除作用強于谷胱甘肽。在低質量濃度范圍內，清除作用隨著質量濃度的增加而增加，在20mg/mL后，清除作用基本穩定。馬面魚骨在10mg/mL時呈微小的下降趨勢，可能是馬面魚骨多肽液顏色的干擾及少量的混濁所致。當馬面魚骨膠原多肽的質量濃度為25mg/mL時，對·OH的清除率達到95.98%。但從整體趨勢分析，馬面魚骨膠原多肽液清除·OH效果明顯，可針對性地應用到具有·OH清除的食品及化妝品中。

2.5.3 馬面魚骨膠原多肽酶解液對DPPH自由基的清除作用

圖 5 魚骨多肽液與谷胱甘肽對DPPH自由基的清除作用比較Fig.5 DPPH radical scavenging activity of collagen peptid from N. septentionalis bone in comparsion with that of GSH

由圖5可知，谷胱甘肽和馬面魚骨多肽液對DPPH自由基清除作用明顯。谷胱甘肽純度高，在2mg/mL時即具有96%的清除作用，而馬面魚骨多肽隨著質量濃度的升高，清除作用呈現臺階式的上升。當達到10mg/mL時的清除作用達85%，接近谷胱甘肽。馬面魚骨膠原多肽的質量濃度為25mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到97.36%。從分析可知谷胱甘肽和魚骨多肽的IC50分別為1.04mg/mL和5.88mg/mL。初步的研究為進一步的分離純化，降低使用量、增加清除作用，提供了良好的科學依據。

3 結 論

通過以上的理化性質分析，馬面魚骨的膠原多肽的氨基酸成分分析中羥脯氨酸含量占總氨基酸含量約為2.66%，膠原多肽的組成主要是分子質量為1～3kD的混合物，并且具有很好的抗氧化活性。當其質量濃度為60mg/mL時，其抗氧化活性中的還原能力與谷胱甘肽相當，當馬面魚骨膠原多肽的質量濃度為25mg/mL時對·OH的清除率和DPPH自由基的清除率分別達到95.98%和97.36%。馬面魚骨膠原多肽，由于其具有良好的抗氧化活性，可以作為功能食品、醫藥產品、化妝品的添加物。

馬面魚骨系列的研究還需要繼續更加深入地分析并分離出魚骨膠原多肽液中的具有較強的抗氧化功能的多肽片段，提高單位質量濃度下的抗氧化作用，降低使用量，降低產品成本。目前在馬面魚骨的實際應用和生產方面，仍有大量魚骨待合理的開發。

[1] 蘇錦祥, 李春生. 中國動物志： 硬骨魚類鲀形目、海蛾魚目、喉盤魚目、鮟鱇目[M]. 北京： 科學出版社, 2002.

[2] 韓陽, 黃元偉, 孫堅, 等. 馬面魚油與魚肉對老年高血壓患者的影響[J]. 中國高血壓雜志. 1994, 2(1)： 96-97.

[3] 陳丕茂, 詹秉義. 綠鰭馬面年齡生長與合理利用[J]. 中國水產科學, 2000, 1(7)： 35-41.

[4] 溫海深, 楊艷平, 陳彩芳, 等. 綠鰭馬面鲀重復發育雄性生殖腺結構與發育組織學觀察[J]. 海洋科學進展, 2010, 2(4)： 209-216.

[5] 趙霞, 馬儷珍. 開發骨蛋白食品前景廣闊[J]. 肉類工業, 2003(1)： 42-43.

[6] 蘇永昌, 劉淑集, 吳成業. 海參多肽的制備工藝優化及其抗氧化測定[J]. 福建水產, 2009(2)： 6-11.

[7] 李燕妮, 曹紅光, 倪艷波. 國內魚膠原蛋白制品的市場研究[J]. 云南化工, 2008, 35(3)： 63-65.

[8] 胡孝勇, 袁曉玲, 蔣寅, 等. 膠原蛋白酶解的研究進展[J]. 現代食品科技, 2008(10)： 1075-1080.

[9] 牛瑞, 于建生. 鱈魚多肽的抗氧化活性及其分離純化[J]. 食品與生物技術學報, 2010(4)： 1673-1689.

[10] 曾少葵, 藍海明, 章超樺, 等. 羅非魚鱗膠原蛋白的提取及其酶解產物的抗氧化性[J]. 上海海洋大學學報, 2009(5)： 599-603.

[11] 劉艷, 劉章武, 唐婧苗. 酶解淡水魚鱗制備水解膠原蛋白的研究[J]. 武漢工業學院學報, 2009, 28(2)： 11-15.

[12] MORRE S, SPACKMAN D H, STEIN W H. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acid[J]. Fedration Proceeding, 1985, 17： 1107-1115.

[13] 趙蒼碧, 黃玉東, 李艷輝. 從牛腱中提取膠原蛋白的研究[J]. 哈爾濱工業大學學報, 2004, 36(4)： 516-519.

[14] 張強, 周正義. 米糠抗氧化肽的分離純化研究[J]. 安徽科技學院學報, 2008, 22(1)： 29-33.

[15] 曹煒, 盧珂, 陳衛軍, 等. 不同種類蜂蜜抗氧化活性的研究[J]. 食品科學, 2005, 26(8)： 352-354.

[16] 張璟, 歐仕益, 張寧. 麥麩酶解產品清除自由的體外實驗研究[J]. 營養學報, 2005, 27(1)： 25-30.

[17] XIE Zhengjun, HUANG Junrong, XU Xueming. Antioxidant activity of peptides isolated from alfalfa leaf protein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2008, 111： 370-376.

[18] YATA M, YOSHIDA C, FUJISAWA S, et al. Identification and cahracterization of molecular species of collagen in fish skin[J]. Journal of Food Science, 2001, 66(2)： 247-251.

[19] 蔣哲, 孟凡國, 陳瓊華, 等. 鯊魚皮膠原蛋白肽的成分分析及對血管緊張素轉化酶活力的影響[J]. 廈門大學自然學報： 自然科學版, 2008(6)： 879-882.

[20] KITTIPHATTANABAWON P, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. Isolation and characterization of collagen from the cartilages of brown banded bamboo shark (Chiloscyllium punctatum) and blacktip shark (Crcharhinu limbatus)[J]. Food Science and Technology, 2010, 43： 792-800.