穿心蓮體內血清指紋圖譜建立

王學志，李文蘭，2* ，白 晶，2，郎 朗，2

1 哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心;2國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076

中藥穿心蓮(Andrographis)系爵床科穿心蓮屬植物，具有清熱抗炎、抗感染、抗心血管疾病、抗生育、抗氧化、抑制腫瘤細胞生長等多種藥理作用［1-5］。研究結果表明:穿心蓮對雄性大鼠精子的形成有顯著影響，雌鼠不易受孕［6，7］，具有一定的生殖毒性。為從體內過程追蹤其藥效物質基礎，分析口服給藥后能進入血液的成分，尋找成分間的相互作用規律，本實驗優化血清樣品的處理方法，以期減少血清中內源性物質的干擾，獲取更多的入血成分信息，并在此基礎上在確定最佳的取血時間和血清處理方法，為下一步體內入血成分的分析提供依據。

1 儀器與材料

Waters 高效液相(HPLC)系統(W2695 泵、W2996DAD 檢測器、自動進樣器、Empower 化學工作站);恒溫水浴(DK80，上海一恒科技有限公司);分析天平(ALC-110.4，上海人和科學儀器有限公司);臺式低溫離心機(Avanti 30，美國BECKMAN);電熱恒溫水浴鍋(DK-80，上海一恒科技有限公司);超聲震蕩儀(H66MC，美國奧好斯科技有限公司);XW-80A 型快速蝸旋器。穿心蓮［Andrographis paniculata (Burm.f.)Nees.］(哈爾濱市圣泰中藥飲片加工廠，批號:080501)。乙腈、甲醇(色譜純，山東禹王);甲酸(色譜純，上海科銳);自制超純凈水、高氯酸(天津市東方化工廠)。Wistar 雄性大鼠(由哈爾濱醫科大學動物中心提供)，體重180～240 g，批號SCXK-(黑)2006-2010。

2 實驗方法

2.1 穿心蓮體外藥材樣品制備

精密稱取100 g 穿心蓮全葉藥材，先用3 倍量的95%的乙醇溫浸2 h，回流提取3 次，第一次用10倍量提取1.5 h、后兩次用7 倍量分提取1 h，合并續濾液55 ℃左右減壓回收乙醇濃縮至1/3 體積［7］。

2.2 色譜條件考察

色譜柱:Waters Symmetry ShieldTMRP18 (3. 9 mm × 150 mm，5 μm);保 護柱:Nova-Pak C18 Guard-PakTM;進樣量:20 μL;流動相:乙腈-0.2%甲酸水溶液洗脫系統;流速:0.8 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:200～400 nm 全波長掃描，篩選最佳的檢測波長。流動相梯度變化程序見表1。

表1 流動相梯度變化程序表Table 1 Gradient elution program of mobile phases

2.3 空白及含藥血清的制備

取Wistar 大鼠4 只，稱重，依據8 g/100 g［7］劑量灌胃，分別給予蒸餾水和灌胃藥液，每次間隔12 h，連續給藥3 d，于末次給藥后用10%水合氯醛麻醉，取血5 mL，置于一次性5 mL 采血管內，室溫放置30 min，待其凝血后，待血凝塊收縮血清充分析出后，以3000 rpm 離心10 min，取上清液2 mL 即得空白和含藥血清。

2.4 血清樣品處理方法考察

針對血清中化學成分的復雜性，以及血中內源性成分的干擾，本實驗取Wistar 大鼠4 只，禁食12 h(自由飲水)，稱重，按照8 g/100 g，灌胃給予“2.1”項下所制藥液后60 min，用10%水合氯醛麻醉，經肝門靜脈取血5 mL，全血靜置凝結后，置于37 ℃水浴中30 min 取出。然后采取以下3 種方法對血清進行預處理。

2.4.1 高氯酸法 精密吸取0.2 mL 含藥血清，加入0.04 mL 0.6%高氯酸，快速混勻10 min，加入重蒸水至1.2 mL，渦旋混勻10 min，15000 rpm 離心20 min，取上清液過0.45 μm 微孔濾膜為含藥血清供試品。同法操作制得空白血清供試品。

2.4.2 甲醇法 精密吸取0.2 mL 含藥血清，加入甲醇至1.2 mL，渦旋混勻10 min，15000 rpm 離心20 min，取上清液過0.45 μm 微孔濾膜為含藥血清供試品。同法操作制得空白血清供試品。

2.4.3 乙酸乙酯法 精密吸取0.2 mL 含藥血清，加2 倍量乙酸乙酯萃取，然后以3000 rpm 離心5 min，吸取上清液，水相再加入4 倍量的甲醇，渦旋2 min，然后以3000 rpm 離心5 min，合并上清液，過0.45 μm 微孔濾膜為含藥血清供試品。同法操作制得空白血清供試品。

由于不同的血清處理方法表現出不同的HPLC圖譜，為了盡可能地表現含藥血清的真實面貌，應對含藥血清采取盡量少的處理步驟，以減少處理過程對血清化學成分產生的影響。根據以上3 個方法，篩選出處理步驟最少且雜質峰較少、峰形較好的血清處理方法。

2.5 最佳取血時間考察

取Wistar 大鼠4 只，禁食12 h(自由飲水)，稱重，按照8 g/100 g，灌胃給予所制藥液后0.5 h，1 h、1.5 h、2 h，用10%水合氯醛麻醉，經肝門靜脈取血5 mL，全血靜置凝結后，置于37 ℃水浴中30 min 取出，甲醇法處理含藥血清以供HPLC 分析。取制好的空白血清樣品及給藥組血清樣品各25 μL，進行HPLC 分析，確定最佳的采血時間。

3 實驗結果

3.1 血清樣品處理方法確定

圖1 不同血清處理方法HPLC 色譜圖比較Fig.1 Comparison of HPLC chromatograms of different serum processing methods

如圖1，高氯酸法和乙酸乙酯法制得的血清樣品，引入血中固有雜質較少，但是能夠檢測的入血成分少，富集能力差，且高氯酸具有強氧化性，給體內成分分析帶來干擾，不適合于本研究。甲醇法此方法制得的血清樣品，被檢測出的入血成分峰較多，分離效果好，富集程度較高，因此確定甲醇法作為本研究的血清樣品制備方法。

3.2 最佳取血時間確定

如圖2，結果表明，給藥后1 h 后的血清樣品中，穿心蓮的入血成分多，峰型好，而且濃度高，最適于分析。因此，選定1 h 為最佳取血時間。

圖2 不同取血時間HPLC 色譜圖比較Fig.2 Comparison of HPLC chromatograms of different blood sampling time

3.3 最佳檢測波長的確定

本實驗采用二極管陣列檢測器，在分析時進行全波長紫外掃描(200～400 nm)，并對同一樣品提取不同波長下的色譜圖，如圖3，經比較結果表明，在275 nm 波長下色譜圖峰形最好，出峰數目適中，各色譜峰相互之間分離度較好(254 nm 下55 min處峰雖高但峰形不好，對下一步質譜分析幫助不大)，故檢測波長定為275 nm。

圖3 不同波長下HPLC 色譜圖比較Fig.3 HPLC chromatograms of samples with different detection wavelengths

3.4 體內血清指紋圖譜建立

如圖4，分別吸取體外藥材樣品、含藥血清、空白血清供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄70 min 色譜圖。共在血清樣品中發現是10 個成分，通過對比逐個峰的色譜圖與光譜圖，結果顯示，1、4、8、9 號峰為原型成分，2、3、5、6、7、10 號峰推測其為體內代謝產物。

圖4 體外藥材樣品、給藥血樣、空白血樣HPLC 色譜圖比較Fig.4 Comparison of HPLC chromatograms of sample directly extracted by rat serum，sample with oral administration of drug and blank rat serum

4 結論

目前對穿心蓮的藥效作用研究比較廣泛，但研究大多限于其解熱、抗菌、抗炎等藥理學作用。關于穿心蓮的生殖毒性及其物質基礎，至今尚未見翔實的研究報道。本實驗確定了在前期實驗［7］已確定有生殖毒性的劑量下給藥后1 h，肝門靜脈取血后采用甲醇處理的方法，來建立穿心蓮血清指紋圖譜，并對穿心蓮體內成分加以分析，得出10 個成分中，有4 個為原型成分，6 個推測其為穿心蓮體內代謝產物，為下一步利用質譜技術分析其成分，代謝途徑及其結構演變提供支持，從而為優化穿心蓮臨床使用的正確的用法、用量，增強用藥的安全性以及為把穿心蓮開發為一種避孕藥提供參考依據。

1 He QE(何恩其)，Zhao F(趙烽).Study progress and pharmacological action of andrographitis.Guid J Tradit Chin Med(中醫藥導報)，2007，13:107-108.

2 Akowuah GA，Zhari I，Mariam A. Analysis of urinary andrographolides and antioxidant status after oral administration of andrographis paniculata leaf extract in rats. Food Chem Toxicol，2008，46:3616-3617.

3 Bhan MK，Dhar AK，Khan S，et al. Screening and optimization of andrographis paniculata(Bunn.f.)Nees for total andrographolide content，yield and its components. Scientia Horticulturae，2006，107:386-391.

4 Yan J，Chen Y，He C，et al.Andrographolide induces cell cycle arrest and apoptosis in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.Cell Biol Toxicol，2012，28:47-56.

5 Dai GF(戴桂馥)，Wang JF(王俊峰)，He SW(何帥偉)，et al.Andrographolide derivatives and its pharmacological activity research progress. Chin Tradit Patent Med(中成藥)，2006，28:1032-1035.

6 Akbarsha MA，Kashman Y，Shukla S，et al. Aspects of the male reproductive toxicity/male anitifertility property of andrographolide in albino rats:effect on the testis and the cauda epididymidal spermatozoa.Phytother Res，2000，14:432-433.

7 Li WL(李文蘭)，Xue J(薛佳)，Wang XZ(王學志)，et al.The research on relationship between time and effects of andrographis reproductive toxicity. J Harbin Univ Commerce，Nat Sci Edi(哈爾濱商業大學學報)，2011，27:645-648.