竹節參培養細胞提取的竹節參總皂苷對大鼠佐劑性關節炎的抑制作用

劉玉萍，王金萍，郭志剛*

1清華大學化工系，北京100084;2 北京軍區總醫院藥理科，北京100700

竹節參(Panax japonicus C.A.Meyer)是五加科人參屬植物，以根狀莖及肉質根入藥，性味甘苦、溫，具有滋補強壯、活血化淤、消腫止痛的功效，是我國的名貴中藥材。由于竹節參的自然種群分布稀少，野生資源瀕臨滅絕，已被列為國家保護植物。科研人員已經從竹節參分離到多種化學成分。主要包括竹節參皂苷、氨基酸、糖類及無機微量元素等［1］。劉家蘭等發現竹節人參提取物的鎮痛和中樞性鎮痛作用明顯［2］。閔靜等發現竹節參皂苷具有良好的免疫調節作用，對于類風濕性關節炎有較好的抗炎作用［3］。王洪武等研究了竹節參皂苷與多糖組合物對免疫低下小鼠免疫功能有促進作用［4］。劉玉萍等的研究證明了竹節參總皂苷具有良好的鎮痛作用［5］。

由于竹節參的產量很低，自然資源有限，本實驗采用竹節參細胞培養提取的竹節參總皂苷，通過Wistar 大鼠構建免疫炎癥病理模型，通過口服給藥，研究竹節參總皂苷對于Wistar 大鼠佐劑性免疫炎癥的治療效果。目的是了解由竹節參培養細胞獲得的竹節參皂苷在提高機體免疫力的效果。同時也驗證竹節參總皂苷的藥效。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Wistar 大鼠，雄性，體重180 ±10 g，購自中國醫學科學院實驗動物繁殖場，合格證號SCXK(京)-2006-0003。每組10 只，合計60 只。竹節參細胞培養總皂苷由清華大學化工系生物化工研究所提供。陽性對照藥雷公藤多苷片由上海復旦復華藥業有限公司提供，10 mg/片(批號:060901)。弗氏完全佐劑由美國 Sigma 公司提供，10 mL/支(批號:124k8942)。

分別稱取適量的竹節參總皂苷粉末，用0.5%Carboxymethyl cellulose-Na(CMC-Na)配成不同濃度:竹節參總皂苷的濃度分別為1、2、4 mg/mL，陽性對照藥物雷公藤多苷的濃度為1 mg/mL。

1.2 病理模型構建

1.2.1 佐劑性關節炎(AA)大鼠模型的制備［6］

將動物隨機分為正常對照組、模型組、陽性藥雷公藤多苷組、竹節參總皂苷高、中、低劑量組。口服給藥，正常對照組和模型組給予等體積0.5% CMCNa，于末次給藥1 h 后每只動物右后足跖皮內注射弗氏完全佐劑0.1 mL 致炎。

1.2.2 給藥方案

1)致炎前5d 口服給藥，觀察藥物對原發性病變的預防效果;在致炎7 d 后連續用藥5 d，觀察藥物對原發性病變的治療作用;2)在致炎后第12 d 再次開始連續用藥10 d，以觀察竹節參總皂苷對繼發病變的治療作用。3)陽性藥組每日口服給雷公藤多苷40 mg/kg，竹節參總皂苷低、中、高劑量組每日口服給藥分別為35、70 和140 mg/kg，正常對照組和模型組給予等體積0.5% CMC-Na。

1.2.3 AA 大鼠原發性病變觀察

測量致炎后第6、18 和24 h AA 大鼠的足腫脹度。觀察AA 大鼠原發性病變。

足腫脹度=(致炎后足體積﹣致炎前足體積)/致炎前足體積，用此公式來計算足腫脹度，此值反映原發性炎癥病變的影響。

1.2.4 AA 大鼠繼發性病變觀察

由于繼發性病變一般表現在致炎第10 d 以后，所以在致炎后第12 d 再次開始連續口服給藥10 d，并于第3、12、15、18、21 和24 d 檢測致炎和非致炎側足的腫脹情況(測量大鼠左、右后足體積)，觀察藥物對AA 大鼠繼發性病變的治療效果，并計算非致炎側足的腫脹度。

1.2.5 數據統計分析

對AA 大鼠的體重、原發性足腫脹度、繼發性足腫脹度進行了檢測和調查。數據為10 只實驗大鼠的平均數和偏差，同時進行了t 測驗分析。

1.2.6 AA 大鼠的病理改變

于造模后第28 d 頸動脈放血處死大鼠，取各組大鼠踝關節置于10%福爾馬林中固定，24 h 后換新福爾馬林繼續固定48 h。選取組織經常規脫水，石蠟包埋，切5 μΜ 薄片，HE 染色，光鏡檢查，并照相。

2 實驗結果

2.1 竹節參總皂苷對AA 大鼠體重的影響

在造模期間，各組大鼠體重均明顯逐步增加。結果見表1。竹節參總皂苷各劑量和陽性藥雷公藤多苷給藥沒有對AA 大鼠的基本生長發育造成傷害。由于模型組和各給藥組與對照組相比AA 大鼠的體重沒有顯著性差異，體重實驗結果不存在系統性誤差。

表1 竹節參總皂苷對AA 大鼠體重的影響(±s，n=10)Table 1 Effects of PJTS on the weight of AA rats (±s，n=10)

表1 竹節參總皂苷對AA 大鼠體重的影響(±s，n=10)Table 1 Effects of PJTS on the weight of AA rats (±s，n=10)

組別Group劑量Dose(mg/kg)0 d3 d15 d18 d21 d24 d 12.4 ±27.3319.8 ±34.8336.3 ±36.7模型組Model－187.3 ± 6.8203.7 ± 9.2279.5 ±19.8308.4 ±25.0319.2 ±26.0333.7 ±29.3陽性組Positive conturol40186.0 ± 7.7200.7 ±11.4282.0 ±22.4311.6 ±15.1320.2 ±23.4332.4 ±34.0低劑量PJTS low dose35184.7 ± 7.5205.2 ± 9.3283.7 ±12.2311.7 ±15.1320.2 ±23.4336.0 ±17.7中劑量PJTS Moderate dose70184.7 ± 6.6200.3 ± 9.2272.8 ±20.2302.3 ±23.6303.8 ±21.5325.4 ±22.4高劑量PJTS High dose140186.0 ± 7.7200.8 ±10.1276.5對照組Control－184.5 ±12.2208.5 ±16.6278.9 ±28.03±17.4297.0 ±34.9304.6 ±21.6326.9 ±25.1

2.2 竹節參總皂苷對AA 大鼠原發性足腫脹度的影響

致炎前連續口服給藥5 d 后開始致炎的實驗結果如表2，除了對照組AA 大鼠原發性足腫脹度沒有變化之外，模型組、陽性藥組與竹節參總皂苷各劑量組分別從致炎后開始腫脹，第6 h 各組以模型組為最大的0.5，陽性組和中劑量竹節參皂苷給藥組的腫脹度分別為0.3，顯著低于模型組。第12 h 后模型組的腫脹度達到0. 7，低劑量竹節參給藥組為0.6，而中劑量和高劑量給藥組的腫脹度只有0.4，顯著低于模型組和低劑量給藥組，并且好于陽性組。第18 h 后模型組的腫脹度達到0.9，而中劑量竹節參皂苷給藥組的腫脹度維持在0.4，顯著低于模型組、低劑量組、高劑量組和陽性組。第24 h，模型組的腫脹度下降為0.7，而中劑量竹節參皂苷給藥組的腫脹度依然穩定在0.4，顯著低于模型組和陽性對照。實驗結果表明，中劑量組處理對于預防和治療AA 大鼠原發性足腫脹具有良好的效果，低劑量組和高劑量組的抗炎效果與陽性藥組基本相同。表明竹節參皂苷對于AA 大鼠的原發性炎癥具有很好的預防和治療效果。

表2 竹節參總皂苷對AA 大鼠原發性足腫脹度的影響(±s，n=10，T-test * p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)Table 2 Effects of PJTS on the primary foot swelling degree of AA rats (±s，n=10，T-test * p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)

表2 竹節參總皂苷對AA 大鼠原發性足腫脹度的影響(±s，n=10，T-test * p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)Table 2 Effects of PJTS on the primary foot swelling degree of AA rats (±s，n=10，T-test * p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)

組別Group劑量dose(mg/kg)致炎后的足腫脹度(mL)Cause inflammation after of the foot degree (mL)0 h6 h12 h18 h24 h對照組Control-0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊0.0 ±0.0＊＊模型組Model0.0 ±0.00.5 ±0.30.7 ±0.20.9 ±0.30.7 ±0.3陽性組Positive control400.0 ±0.00.3 ±0.2*0.5 ±0.2*0.6 ±0.1*0.5 ±0.1*低劑量組PJTS low dose350.0 ±0.00.4 ±0.10.6 ±0.20.6 ±0.1*0.5 ±0.1*中劑量組PJTS Moderate dose700.0 ±0.00.3 ±0.1*0.4 ±0.2＊＊0.4 ±0.2＊＊0.4 ±0.1＊＊高劑量組PJTS High dose1400.0 ±0.00.4 ±0.10.4 ±0.1＊＊0.6 ±0.1*0.5 ±0.2*

2.3 竹節參總皂苷對AA 大鼠繼發性足腫脹度的影響

竹節參總皂苷對AA 大鼠繼發性足腫脹度的消炎和治療實驗自致炎后第12 d 起又繼續口服給藥，同時觀察AA 大鼠繼發性病變的情況。實驗結果如表3 所示，在致炎后第12 d，模型組和低劑量竹節參皂苷給藥組的足腫脹度為0.5，陽性藥組以及中、高劑量竹節參總皂苷給藥組的足腫脹度分別為0.3～0.4，表明在致炎前口服給藥5 d 的抗炎效果依然存在。模型組的個別大鼠有結節出現，并伴有體重減輕等癥狀。從致炎后第12 d 起開始二次用藥，3 d后也就是在第15 d，模型組的足腫脹度降低到0.3，而陽性藥組和低劑量竹節參皂苷給藥組的足腫脹度降低到0.1，中劑量和高劑量竹節參皂苷給藥組的足腫脹度降低到0。在用藥后第6 d(18 d)模型組的腫脹度仍然維持在0.3，陽性藥組和低劑量給藥組的腫脹度也降低到0，極顯著地低于模型組的足腫脹度，表現出竹節參皂苷良好的消炎與消腫效果。致炎后第12 d 模型組與各處理組的原發性足腫脹度雖然均有所下降，但是仍維持在0.5～0.3 范圍內。再次開始給藥后，給藥組分別在第15 d 和18 d均徹底消除了足腫脹，達到了很好的治療效果。實驗結果充分證明竹節參總皂苷對于AA 大鼠繼發性炎癥具有很好的治療效果。

結合大鼠原發性與繼發性足腫脹的結果可以清楚地看到，自致炎開始AA 大鼠的右足開始腫脹，在第6 h，除了對照組之外，各處理組的AA 大鼠的原發性足腫脹度均達到了0.3～0.5，在第16 h 足腫脹度達到最高峰，之后開始消腫。同時可以看到，在致炎前5 d 開始口服給藥的AA 大鼠的足腫脹度均顯著低于模型組。表明竹節參皂苷和雷公藤多苷對于AA 大鼠的原發性炎癥具有很好的預防效果。在致炎后第12 d 模型組與各處理組的原發性足腫脹度雖然均有所下降，但是仍維持在0.5～0.3 的范圍內。再次開始給藥后發現，給藥組分別在第15 d和18 d 均徹底消除了足腫脹，達到了很好的治療效果。實驗結果充分證明了竹節參總皂苷對于AA 大鼠原發性和繼發性炎癥都具有良好的治療效果。特別是中高級量的治療效果要優于雷公藤多苷。

表3 竹節參總皂苷對AA 大鼠繼發性足腫脹度的影響(±s，n=10，T-test * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01)Table 3 Effects of PJTS on the secondary foot swelling degree of AA rats (±s，n=10，T-test * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01)

表3 竹節參總皂苷對AA 大鼠繼發性足腫脹度的影響(±s，n=10，T-test * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01)Table 3 Effects of PJTS on the secondary foot swelling degree of AA rats (±s，n=10，T-test * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01)

組別Group劑量Dose(mg/kg)致炎后的足腫脹度(mL)Cause inflammation after of the foot degree(mL)12 d15 d18 d對照組Control－0.1 ±0.1＊＊0.1 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊模型組Model－0.5 ±0.20.3 ±0.10.3 ±0.1陽性組Positive control400.4 ±0.1*0.1 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊低劑量組PJTS Low dose350.5 ±0.10.1 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊中劑量組PJTS Moderate dose700.4 ±0.1*0.0 ±0.2＊＊0.0 ±0.1＊＊高劑量組PJTS High dose1400.3 ±0.1*0.0 ±0.1＊＊0.0 ±0.1＊＊

2.4 竹節參總皂苷對AA 大鼠足爪關節病理組織的影響

實驗結束后，在光鏡下觀察足爪組織并攝片。病理分級為:0 級:足爪組織結構無名顯異常。Ⅰ級:足爪組織有少量炎性細胞浸潤。Ⅱ級:足爪組織有較多炎性細胞浸潤。Ⅲ級:足爪組織有大量炎性細胞浸潤，伴明顯間質水腫。

足爪組織病理切片見圖1。對照組的關節滑膜組織由1～2 層滑膜細胞及滑膜下層組成，可見少許小血管，滑膜細胞排列整齊，關節面光滑，腔內無滲出，屬于0 級無炎癥的正常組織。而AA 大鼠足爪模型組織的病理切片發現明顯有增生、肉芽腫、巨噬細胞，滑膜囊內有大量炎性細胞，伴明顯間質水腫，其病理分級屬于Ⅲ級。而竹節參總皂苷處理組和陽性組的病理切片雖然存在輕微的細胞浸潤現象，但是沒有增生和肉芽腫等嚴重間質水腫發生。其病理分級應該處于0～Ⅰ級之間。表明竹節參皂苷對于AA 大鼠的關節炎癥具有明顯的治療作用。

圖1 竹節參總皂苷對AA 大鼠足爪關節病理組織的影響(HE 染色，×100)Fig.1 Effects of PJTS on the foot claw joint pathology organization of AA rats

3 討論

炎癥(inflammation)是具有血管系統的活體組織對損傷因子所發生的防御反應。任何損傷因子在引起細胞和組織損傷的同時，也刺激生物體產生防御反應。它是人類疾病中一種最常見的病理、生理過程，可以發生于機體的任何部位和任何組織［7］。當致炎因子作用于機體時，機體通過炎癥反應消除致炎因子，保護機體免受異物或致病因素的損害，同時又通過自身抗炎機制限制炎癥的范圍，維持機體的穩態。整個過程中實際貫穿著兩對主要矛盾:損害與抗損害，炎癥與抗炎癥的斗爭，兩對矛盾關系密切，相互依賴，兩者的力量對比變化決定了炎癥的發生和發展。機體在正常情況下，如果有病原體入侵，會誘導炎性細胞活化、補體活化以及炎癥介質的產生。同時，會動員機體自身抗炎機制限制這種活化，保護宿主免受炎癥損傷。結果是損害與抗損害，炎癥與抗炎癥在機體達成一種平衡，當這一平衡由于外在因素(如致炎因子的強烈攻擊)或內在因素(如自身抗炎機制減弱)而失調時，即可出現病理學上炎癥反應:紅、腫、熱、痛及肉芽組織形成。

大鼠AA 模型是一種免疫性炎癥模型，主要以細胞免疫功能紊亂而導致關節損傷的一種關節炎模型。一般分兩個時相，即原發性和繼發性反應期，其中原發性反應為非特異性急性炎癥，而繼發性反應則是免疫功能紊亂造成免疫性炎癥表現。本研究根據以往的成功經驗，選用Wistar 雄性大鼠右后足皮內注射完全弗氏佐劑造模，觀察竹節參總皂苷對AA 大鼠模型的影響。測量和觀察注射足的初始腫脹度以反映AA 大鼠原發性炎癥變化，當注射完全弗氏佐劑18 h 后注射足腫脹達到高峰，以后腫脹度逐漸相對下降。觀察AA 大鼠繼發性病變的結果顯示，大鼠于致炎后第10 d 起其左足也開始腫脹，第18 d 達到腫脹高峰，由于遲發型超敏反應，使側后肢、前肢各關節周圍等部位均出現紅腫、紅斑、個別模型動物出現炎性結節，且進行性加重，模型動物伴有行動不便等全身性癥狀。而口服竹節參總皂苷的大鼠不僅能有效抑制原發性炎癥，也明顯地抑制了AA 大鼠的繼發性炎癥。通過病理切片進行組織學觀察，模型組的滑膜組織明顯增生，肉芽腫形成，巨噬細胞及滑膜囊內大量炎性細胞浸潤，關節軟骨侵蝕及骨組織破壞，與人類的類風濕關節炎(RA)十分相似［8］。而口服竹節參總皂苷的大鼠明顯地減輕了關節炎性細胞的浸潤、促進巨噬細胞的形成。該試驗結果為解釋文獻記載的竹節參能夠治療風濕痹癥提供了實驗依據。

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7 Li GD(李甘地). Pathology(病理學). Beijing:People’s Medical Publishing House，2001.81.

8 Wang Y(汪悅)，Guo HY(郭海鷹)，Geng YQ(耿元卿).The effect of Bitongling particles on splenocyte proliferation on on adjuvant arthritis AA rat.Chin J Tradit Med Sci Tech(中國中醫藥科技)，2004，5:276.