石參總黃酮對一氧化氮致大鼠胰島細胞損傷的保護作用

吳偉斌，龐建新，曹 瑩，謝寶平，丘玉昌

南方醫科大學藥學院新藥評價中心，廣州510515

近年來的研究表明，NO 引起的氧化應激損傷是引起糖尿病的重要環節［1］，相對于機體其他組織細胞，胰島β 細胞更容易受到NO 的攻擊，導致功能缺陷［2］。因此，阻斷NO 引起的胰島細胞損傷，成為防治糖尿病的重要途徑。

石參(Urariacrinita)是豆科(Leguminosae)植物貓尾射(Uraria crinite Desv.)的干燥根，據《廣西中藥志》記載，其味甘，氣香，性溫無毒;有行氣止痛，逐飲化痰，治心胃氣痛，痰飲咳嗽之功效［3］。以往對于石參藥理作用的研究少有報道。我們前期研究表明，石參的提取液具有降低II 型糖尿病小鼠的空腹血糖、改善糖耐量、促進胰島素分泌的作用［4］;來源于石參的總黃酮具有較強的抗氧化能力［5］。本實驗中，我們采用SNP 作為NO 供體，觀察石參總黃酮對NO 引起的胰島β 細胞損傷的保護作用，并探討可能的作用機制，為進一步開發利用石參打下基礎。

1 材料與方法

1.1 石參總黃酮的制備

石參總黃酮的制備參見文獻［5］。

1.2 細胞

大鼠胰島β 細胞株RIN-m，購自美國ATCC。

1.3 試劑

1640 基礎培養基(Hyclone);胎牛血清(FBS)(杭州四季青);青鏈霉素(北京吉諾);3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(sigma);硝普鈉(Sodium Nitroprusside，SNP)(國藥集團化學試劑有限公司);DMSO(廣州化學試劑廠);總谷胱甘肽、總SOD 活性、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

1.4 儀器

二氧化碳培養箱(Thermo);恒溫水浴箱(上海一恒);恒溫培養箱(Shel Lab);高速低溫離心機(Sigma);連續波長紫外分光光度計(Bio-Rad);

1.5 RIN-m 細胞SNP 損傷模型的構建

RIN-m 細胞用含10%FBS、1%青鏈霉素的1640完全培養基培養，對數生長期細胞按1 ×104/孔的細胞量鋪入96 孔板中，培養過夜后，加入不同濃度的SNP(5、8、10、15、20 mmol/L)，分別培養3 h 和4 h。培養結束后，吸棄培養基，每孔加入100 μL 的新鮮培養基和10 μL 的含5 mg/mL MTT 的PBS 溶液，繼續培養4 h，吸棄培養基，每孔加入DMSO100 μL，于570 nm 波長處讀數。每組3 個復孔。

1.6 石參總黃酮對細胞活力的影響

對數生長期RIN-m 細胞按1 ×104/孔的細胞量鋪入96 孔板中。把含有梯度濃度的石參總黃酮的完全培養基加入孔板，培養4 h 后，更換培養基為含10 mmol/LSNP 的完全培養基，再培養3 h 后，吸棄培養基，及后每孔加入100 μL 的新鮮培養基和10 μL 的含5 mg/mL MTT 的PBS 溶液;培養4 h 后，吸棄培養基，每孔加入DMSO100 μL，于570 nm 波長處讀數。實驗分為空白組、模型組、給藥組(分別含石參總黃酮0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL)。每組3 個復孔。

1.7 石參總黃酮對細胞內MAD 含量和總SOD 活性的影響

對數生長期RIN-m 細胞按1 ×104/孔的細胞量鋪入96 孔板中。把含有梯度濃度的石參總黃酮的完全培養基加入孔板，培養4 h 后，更換培養基為含10 mmol/L SNP 的完全培養基，再培養3 h 后，吸棄上清，孔板置于冰上，以預冷的PBS 蕩洗細胞兩次，完全吸去PBS 后，每孔加入細胞裂解液200 μL，冰浴中裂解90 min，后用低溫高速離心機4 ℃下以1600 g 離心10 min，取上清。按照試劑盒的步驟檢測細胞內丙二醛(MDA)的含量和總SOD 活性。實驗分為空白組、模型組、給藥組(分別含石參總黃酮0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL)。每組3 個復孔。

1.8 石參總黃酮對細胞內總谷胱甘肽含量的影響

對數生長期RIN-m 細胞按1 ×104/孔的細胞量鋪入96 孔板中。把含有梯度濃度的石參總黃酮的完全培養基加入孔板，培養4 h 后，更換培養基為含10 mmol/L SNP 的完全培養基，再培養3 h 后，吸棄上清，孔板置于冰上，以預冷的PBS 蕩洗細胞兩次，完全吸去PBS 后，按試劑盒要求，每孔加入蛋白去除試劑S100 μL，冰浴中用細胞刮子刮下細胞，收集于EP 管中，并在液氮和37 ℃溫水中進行兩次反復凍融。然后用低溫高速離心機4 ℃下以10000 g 離心10 min，取上清，按試劑盒步驟檢測總谷胱甘肽的含量。實驗分為空白組、模型組、給藥組(分別含石參總黃酮0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL)。每組3 個復孔。

1.9 統計分析

實驗數據均以mean ±SD 表示，使用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析，使用LSD 進行組間的兩兩比較，P ＜0.05 視為有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 RIN-m 細胞SNP 損傷模型的構建

SNP 是外源性NO 供體，在培養液中轉變為NO而損傷細胞。如圖1 所示，不同濃度的SNP 作用于RIN-m 細胞后，均使OD 值明顯下降，表明細胞受到NO 的損傷。其中10 mMSNP 作用3 h，使細胞活力下降約50%(與空白對照比)，因此，后續實驗選擇10mMSNP 作用3 h 構建損傷模型。

2.2 石參總黃酮對細胞活力的影響

圖2 顯示，石參總黃酮在0.05～0.3 mg/mL 范圍內，能顯著提高細胞的活性(P ＜0.05)，表明石參總黃酮對受SNP 損傷的RIN-m 細胞具有保護作用，并呈一定的濃度依賴性(方差不齊)。

2.3 石參總黃酮對細胞內MAD 含量的影響

從圖3 可以看出，受NO 損傷后，細胞內MAD含量明顯升高，石參總黃酮在0.05～0.3 mg/mL 范圍內，明顯降低損傷細胞內MAD 含量，表明石參總黃酮能減輕NO 所致的細胞脂質過氧化程度。

圖3 石參總黃酮對細胞內MDA 含量的影響Fig.3 Effect of UCRFs on intracellular MDA content

2.4 石參總黃酮對細胞內總SOD 活性的影響

圖4 顯示，受NO 損傷后，細胞內總SOD 活性明顯下降，石參總黃酮在0.05mg/mL～0.3mg/mL 范圍內，明顯提高損傷細胞內總SOD 活性(P ＜0.05)，并呈一定的濃度依賴性。

圖4 石參總黃酮對細胞內SOD 活性的影響Fig.4 Effects of UCRFs on intracellular SOD activity

2.5 石參總黃酮對損傷細胞內總谷胱甘肽含量的影響

從圖5 可以看出，受NO 損傷后，細胞內總谷胱甘肽含量明顯下降，石參總黃酮在0.1 mg/mL～0.3 mg/mL 范圍內，顯著提高損傷細胞內總谷胱甘肽含量(P ＜0.05)。

圖5 石參總黃酮對細胞內總谷胱甘肽濃度的影響Fig.5 Effects of UCRFs on intracellular total GSH content

3 討論

本實驗中，我們用SNP 作為NO 的外源性供體加入到培養體系，造成NO 對胰島β 細胞的損傷。一氧化氮(NO)是一種弱自由基，通過多種途徑參與糖尿病的發生發展過程。NO 可直接抑制細胞線粒體的能量代謝，損傷DNA，導致胰島細胞發生凋亡或壞死［6］;此外，NO 還可以與活性氧類中間產物發生反應，生成過氧亞硝酸鹽陰離子(OONO-)等活性氮(reactive nitrogen species，RNS)和(或)活性氧類(reactive oxygen species，ROS)物質，進而損傷細胞［7，8］，最終導致胰島β 細胞功能障礙。

本實驗中，石參總黃酮能明顯提高SNP 損傷后細胞的活力，降低細胞MAD 含量，表明石參總黃酮對受NO 損傷的RIN-m 細胞具有較好的保護作用。GSH 和SOD 是細胞內自身存在的重要的對抗NO損傷的物質。GSH 可清除細胞內親電基團，調節NO 平衡［9］;SOD 主要清除細胞代謝產生的超氧陰離子，在減少過氧亞硝酸根生成的過程中起主要作用［10］。給予石參總黃酮后，細胞內GSH 含量和SOD 的活性均顯著性上升，提示石參總黃酮可能通過提高RIN-m 細胞自身的抗氧化能力來抵抗NO 引起的損傷。

以上結果顯示，石參總黃酮對NO 所致的胰島細胞損傷具有較好的保護作用，具有一定的開發價值。

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3 Guangxi Municipal Health Bureau(廣西壯族自治區衛生廳). History of Chinese medicine in Guangxi(廣西中藥志). Nanning:Guangxi People’s Publishing House，1963，Vol II，392.

4 Liu X，Cao Y，Kong H，et al.Antihyperglycemic and antihyperlipidemic effect of Uraria crinita water extract in diabetic mice induced by STZ and food. J Med Plants Res，2010，4:370-374.

5 Luo C (羅超)，Liu AM (劉靄明)，Xing WQ (邢惟青)，et al.Antioxidant effect of flavonoids from Uraria crinita. Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學雜志)，2011，17:198-201.

6 Kassab A，Piwowar A. Cell oxidant stress delivery and cell dysfunction onset in type 2 diabetes. Biochimie，2012，94 :1837-1848.

7 Kroncke KD，Fehsel K，Kolb-Bachofen V.Nitric oxide:cytotoxicity versus cytoprotection--how，why，when，and where?Nitric Oxide，1997，1:107-120.

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