大黃酸氨基酸衍生物合成及放射增敏作用的初步研究

李濟洋，朱澤紅，郝建秀，周則衛，李瑞峰，李光強，徐文清

中國醫學科學院北京協和醫學院放射醫學研究所藥物室，天津300192

放射療法是現代腫瘤治療的主要手段，射線照射生物體后，直接損傷生物大分子DNA 或通過其產生的自由基間接損傷DNA 或細胞［1］。由于腫瘤細胞增殖快，導致腫瘤細胞內部的細胞乏氧。這是腫瘤細胞對射線不敏感的重要因素［2］。放射增敏劑能夠提高腫瘤中乏氧細胞對射線的敏感性，增強射線對腫瘤的細胞的殺傷效應，對提高臨床放療效果具有重要意義。

近年來的研究表明，大黃酸可通過促進細胞凋亡［3］、細胞周期抑制［4］、阻止DNA 損傷修復［5］、抑制血管生成［6］等作用發揮一定的抗癌活性。由于癌細胞增殖迅速，需要更多的氨基酸，如嘗試將大黃酸與各種氨基酸分子連接，組成新的化合物，則有可能更易將目標化合物靶向作用于癌細胞。本文選用大黃酸作為母體，引入腫瘤增殖中大量需要的氨基酸，進行放射增敏活性的研究。希望能從此類化合物中尋找到具有較好放射增敏活性且低毒副作用的候選化合物，為蒽醌類天然產物放射增敏劑的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

大黃酸(南京澤朗醫藥科技有限公司，純度＞98.0%)，L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸，L-色氨酸，L-蛋氨酸，L-脯氨酸(北京鼎國生物技術有限公司，純度＞99.0%);2-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽(上海瀚鴻化工科技有限公司，純度＞99.0%);甲醇、甲苯、甲酸、二氯甲烷、氯仿、石油醚、N，N 二甲基甲酰胺、三乙胺、二氯亞砜、鹽酸(天津市化學試劑二廠，分析純);氫氧化鈉(天津市化學試劑三廠，分析純);硅膠(青島海洋化工);薄層預制板(煙臺江友硅膠開發有限公司)等。鹽酸表柔比星(浙江海正藥業，10 mg/支);DMEM 培養基(Invitrogen Corporation);胎牛血清(購自中國醫學科學院血液研究所);胰酶(Genview);MTT(Genview，純度＞98.0%);DMSO(天津復光精細化工)。肺癌H460 細胞(中國醫學科學院基礎醫學研究所)。137Cs 放射源，劑量率:0.78 Gy/min。

冷阱(河南鞏義予華儀器有限公司);超聲儀(天津市瑞普電子儀器公司);BUCHI 1535 熔點測定儀(瑞士BUCHI 公司);RE-5299 旋轉蒸發儀(鞏義市予華儀器有限責任公司);恒溫磁力攪拌器(河南鞏義市英峪予華儀器有限責任公司);循環水真空泵(河南鞏義市英峪予華儀器有限責任公司);水浴鍋(北京醫療設備總廠);BS124S 電子天平(Sartorius);高效液相色譜儀(Waters2695);Varian Mercury V×300 型核磁共振儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 合成部分

先將氨基酸酯化，保護羧基。再用EDC 和HOBt 在堿性條件下，使大黃酸與氨基酸甲酯縮合。然后堿化脫酯，再酸化得到縮合產物。

?

1.2.2 合成實驗過程

1.2.2.1 亮氨酸、異亮氨酸和色氨酸甲酯鹽酸鹽的合成

加50 mL 甲醇于100 mL 圓底燒瓶中，置于冷阱中15 min，溫度計測定燒瓶內甲醇溫度保持在-10℃以下。稱取1.5 g 亮氨酸(異亮氨酸、色氨酸)，加入圓底燒瓶中。沿瓶壁，緩慢多次地加入1.5 eq 的二氯亞砜液體，期間隨時監測瓶內溫度，保持在-10℃以下。然后冷阱中攪拌至氨基酸溶解后，繼續攪拌1 h，再轉移至室溫，攪拌過夜。發現析出少量白色晶體，減壓抽干，加入適量二氯甲烷，反復抽干兩次，得到亮氨酸(異亮氨酸、色氨酸)甲酯鹽酸鹽。測定固體熔點，與文獻值比較。

1.2.2.2 天冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸和脯氨酸甲酯的合成

同上，試圖合成天冬氨酸(谷氨酸、蛋氨酸、脯氨酸)甲酯鹽酸鹽。加入二氯亞砜(天冬氨酸和谷氨酸加3 eq)，室溫攪拌過夜后，發現未析出白色晶體。減壓抽濾，無法抽干，得到的是粘稠油狀物。向油狀物加入一定量的0.5 mol/L NaOH 液體，攪拌溶解，pH 試紙檢測pH 至中性或略堿性。用二氯甲烷反復多次萃取該溶液，TCL(氯仿∶三乙胺 = 30∶1)，茚三酮顯色，與原料比較。只有一個比明顯較原料極性小的點時，保留溶液，待用。

1.2.2.3 大黃酰氨基酸甲酯的合成

在50 mL 圓底燒瓶中加入40 mg 大黃酸，38.4 mg EDC(HCl，20 mg HOBt，2eq 的氨基酸鹽酸鹽或適量的氨基酸甲酯液體，然后加入適量二氯甲烷，再加入4～5 eq 的三乙胺，攪拌，溶解，變紫紅色澄清液體。室溫攪拌5 h，TCL(氯仿作展開劑)監測反應。過柱，氯仿洗脫，收集第二條帶，旋干得大黃酰氨基酸酯。

1.2.2.4 大黃酰氨基酸的合成

向上述大黃酰氨基酸甲酯中，加入1 M NaOH溶液，45 ℃攪拌1 h 后，逐滴加入10%鹽酸，紫色溶液變淺，至析出淡黃色固體，再加兩滴，至溶液攪拌不再變紫。過濾，再用水沖洗兩遍，乙醇沖洗一遍，干燥，得黃色大黃酰氨基酸固體。TCL(甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸 = 7.5∶2∶0.5)得只有一個比原料大黃酸極性大的黃點。測算產率，打譜。

1.2.3 抑瘤活性測定

1.2.3.1 待測儲備液配制

大黃酸衍生物適量溶于1.2 個當量5% NaHCO3溶液中，水浴蒸干，得到紫色的大黃酰氨基酸鈉鹽，分別稱取其鈉鹽適量用5%葡萄糖注射液配制成適宜濃度的儲備液，0.22 μm 濾膜過濾，除菌后密封冷藏備用。同理，配制了大黃酸鈉的儲備液作為1 號化合物，以及表柔比星陽性對照液。

1.2.3.2 MTT 法測IC50和IC20值

肺癌H460 細胞接種于含10%牛血清的DMEM培養基中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，每2～3 d 更換培養液，細胞鋪滿培養瓶后傳代。取對數生長期細胞，經0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，計數并稀釋成2 ×104個/mL 細胞液，按200 μL/孔接種于96 孔培養板中，37 ℃、5% CO2的培養箱培養24 h 使細胞貼壁生長。用各化合物貯備液逐級稀釋6～7 個濃度梯度給藥，每組5～6 個復孔，培養24、48 h 后，加入MTT 試液(5 mg/mL)15 μL，繼續培養4 h，吸出培養液，加入DMSO 150 μL/孔，振搖5 min，酶標儀492 nm 處測定吸收值，根據下式計算生長抑制率，擬合劑量存活曲線，計算各藥物IC50及IC20值。

1.2.4 各化合物的放射增敏活性初步評價

由MTT 結果，選取大黃酰亮氨酸鈉和大黃酰異亮氨酸鈉做初步放射增敏實驗，大黃酸鈉作原料對比，表柔比星作為陽性對照。選取這四個化合物的48 h IC15和IC20值作放射增敏測試濃度。按2 ×104個/mL 細胞液，200 μL/孔接種于96 孔培養板中，37℃、5%CO2的培養箱培養24 h 使細胞貼壁生長。加藥，培養24 h 后照射。分五個劑量組，0、1、2、4、6 Gy，照射后繼續培養24 h，加入15 μL MTT(5 mg/mL)試液，培養4 h，吸出培養液，加入DMSO 150 μL/孔，振搖5 min，酶標儀492 nm 處測定吸收值。用單因素方差分析法比較單純照射組和照射合并給藥組，初步判斷是否有放射增敏作用。

2 結果與討論

2.1 合成實驗結果

2.1.1 HPLC 純度測定結果

色譜條件:ODS 色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm);流動相:甲醇∶0.1%磷酸水溶液(85∶15);流速:l mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:254 nm;進樣量:10 μL。樣品濃度:10～20 μg/mL。面積歸一化法計算，各化合物純度均大于95.0%。

2.1.2 產率和結構鑒定結果

化合物2 黃色粉末狀固體;mp. 201～205 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ (ppm):12. 69 (s，1H，4'-COOH)，11. 89(s，2H，1 and 8-OH)，9.10-9.07 (d，1H，2'-H)，8.17-8.16 (s，1H，4-H)，7.85～7.73 (m，3H，5，6，7-H)，7.42-7.39 (d，1H，2-H)，4.49-4.42 (m，1H，3'-H)，1.84-1.58 (m，3H，5'-H，6'-H)，0.95～0.88 (dd，6H，7'-H，8'-H)，產率64.3%。

化合物3 黃色粉末狀固體;mp. 210～212 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ (ppm):12. 73 (s，1H，4'-COOH)，11. 91(s，2H，1 and 8-OH)，9.00～8.97 (d，1H，2'-H)，8.12 (s，1H，4-H)，7.85～7.72 (m，3H，5，6，7-H)，7. 42～7. 39 (d，1H，2-H)，4. 36-4. 31 (t，1H，3'-H)，1.97 (s，1H，5'-H)，1.34～1.22 (m，2H，7'-H)，0.96-0.86 (m，6H，6'-H，8'-H)，產率60.2%。

化合物4 黃色粉末狀固體;mp. 214～218 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ (ppm):12. 72 (s，2H，4'and 6'-COOH)，11.87 (s，2H，1 and 8-OH)，9.23-9.20 (d，1H，2'-H)，8.13 (s，1H，4-H)，7.84-7.72 (m，3H，5，6，7-H)，7.41～7.33 (t，1H，2-H)，4.80～4.72 (q，1H，3'-H)，2. 91-2. 70 (m，2H，5'-H)，產率28.9%。

化合物5 黃色粉末狀固體;mp. 221～225 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ (ppm):12. 42 (s，2H，4'and 7'-COOH)，11.83～11.81 (d，2H，1 and 8-OH)，9.05～9.03(d，1H，2'-H)，8.12 (s，1H，4-H)，7.80～7.68(m，3H，5，6，7-H)，7.36～7.39 (d，1H，2-H)，4.44 (s，1H，3'-H)，2.40～2.36 (t，2H，6'-H)，2.14～1.95 (m，2H，5'-H)，產率35.7%。

化合物6 棕色粉末狀固體;mp. 140～142 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ(ppm):12.70 (s，1H，4'-COOH)，11.83 (s，2H，1 and 8-OH)，10.78 (s，1H，8'-H)，9.12 (s，1H，2'-H)，8.08 (s，1H，4-H)，7.79～7.70 (m，3H，5，6，7-H)，7.60～7.57 (d，1H，2-H)，7.36～7.28 (m，2H，11' and 14'-H)，7.19 (s，1H，7'-H)，7.06～6.94 (m，2H，12' and 13'-H)，4. 69(s，1H，3'-H)，3.35～3.19 (m，2H，5'-H)，產率27.8%。

化合物7 黃色粉末狀固體;mp. 237～240 ℃(分解);1H NMR (300 MHz;DMSO-d6/TMS，25 ℃)δ(ppm):12. 77 (s，1H，4'-COOH)，11. 84 (s，2H，1 and 8-OH)，9.08-9.06 (d，1H，2'-H)，8.12(s，1H，4-H)，7.77～7.68 (m，3H，5，6，7-H)，7.37-7.34 (d，1H，2-H)，4.55～4.53 (d，1H，3'-H)，2.59～2.56 (d，2H，5'-H)，2.06 (s，5H，6'and 8'-H)，產率33.6%。

化合物8 黃色粉末狀固體;mp. 114～117 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ(ppm):12.67 (s，1H，7'-COOH)，11.88 (s，2H，1 and 8-OH)，8.06 (s，1H，4-H)，7.80-7.51(m，3H，5，6，7-H)，7.39～7.12 (m，1H，2-H)，4.43～4.34 (m，1H，3'-H)，3.61-3.49 (m，2H，6'-H)，2.30～2.29 (d，2H，4'-H)，1.90 (s，2H，5'-H)，產率21.5%。

化合物9 黃色粉末狀固體;mp. 260～266 ℃(分解);1H NMR (300 MHz，DMSO-d6/TMS，25℃)δ(ppm):12.76 (s，1H，4'-COOH)，11.89 (s，1H，1 or 8 -OH)，9.08 (s，1H，2'-H)，8.16(s，1H，4-H)，7.81～7.68 (m，3H，5，6，7-H)，7.41～7.31 (d，1H，2-H)，4.30 (s，1H，3'-H)，1.85-1.64 (m，2H，5'-H)，1.03～0.97 (m，3H，6'-H)，產率72.4%。

2.2 MTT 實驗結果

圖3 各化合物對H460 細胞作用24 h 和48 h 后的IC20和IC50值Fig.3 IC20 and IC50 values of each compound after 24 h and 48 h treatment in H460 cells

表2 各化合物分別作用24、48 h 后對H460 細胞的增殖抑制作用結果Table 2 Inhibitory effects of each compound on H460 cells in 24 h and 48 h

如圖3 所示，大黃酰亮氨酸鈉(化合物2)和大黃酰異亮氨酸鈉(化合物3)在24 h 的IC20和IC50值顯著小于大黃酸鈉的值。雖然48 h 的數值差距變小，但也說明了這兩個化合物較原料大黃酸鈉有更顯著的抑制作用。而其他化合物的抑制作用較原料無明顯提高，甚至有明顯下降(化合物4 和5)。詳細數據可見表2。該部分實驗數據使用SPSS 17.0單因素ANOVA 方差分析檢驗，P ＜0.05 具有顯著性差異。

2.3 增敏實驗結果

由圖4 所見，相對于單純照射組，大黃酸鈉和大黃酸亮氨酸鈉并未表現出放射增敏作用。而照射合并大黃酸異亮氨酸鈉(化合物3)組的吸收值雖大于陽性對照組，但小于單純照射組。說明大黃酰異亮氨酸鈉表現出了放射增敏作用。表3 所列的是選取化合物合并照射作用得到的詳細OD(492 nm)吸收值。括號內數字是各化合物的給藥濃度，單位為μmol/L。

圖4 所選取化合物的放射增敏結果Fig.4 Radiosensitizing results of selected compounds

表3 所選取化合物合并照射所得OD492吸收值(n = 6，±s)Table 3 OD492 values obtained by combining selected compounds with radiation(n = 6，±s)

表3 所選取化合物合并照射所得OD492吸收值(n = 6，±s)Table 3 OD492 values obtained by combining selected compounds with radiation(n = 6，±s)

注:與單純對照組相比，(P ＜0.01;* P ＜0.05Note:Compare with control，#P ＜0.01;* P ＜0.05

劑量(dosage)單純照射組(radiation alone)照射合并表柔比星(combine radiation with Epirubicin )照射合并大黃酸鈉(combine radiation with sodium rhein)照射合并大黃酰亮氨酸鈉(combine radiation with sodium rhein-Leu)照射合并大黃酰亮氨酸鈉(combine radiation with sodium rhein-Leu )IC15(1.01) IC20(1.42) IC15(40.87)IC20(55.89) IC15(7.07) IC20(11.47)IC15(52.71) IC20(66.45)01.926 ±0.089 1.019 ±0.057*1.099 ±0.199*1.876 ±0.068 1.810 ±0.102 1.996 ±0.234 1.921 ±0.044 1.696 ±0.044*1.587 ±0.079*1.416 ±0.079*21.436 ±0.028 11.719 ±0.048 0.767 ±0.123*0.583 ±0.059*1.526 ±0.071*1.427 ±0.049*1.709 ±0.085 1.728 ±0.077 1.513 ±0.103*1.107 ±0.113*41.199 ±0.041 0.557 ±0.060*0.433 ±0.060*1.334 ±0.437*1.309 ±0.037*1.405 ±0.038 1.407 ±0.038 1.226 ±0.056*0.877 ±0.081*60.877 ±0.052 0.500 ±0.029*0.348 ±0.043*1.115 ±0.079*1.033 ±0.031*1.078 ±0.034*1.084 ±0.035*0.953 ±0.057*0.345 ±0.069*0.290 ±0.035*0.821 ±0.122 0.840 ±0.066 0.832 ±0.087 0.830 ±0.043 0.743 ±0.048*0.692 ±0.043*

2.4 討論

近年來的研究發現，大黃酸對乳腺癌［7］、宮頸癌［8］、結腸癌［9］、鼻咽癌［10］、肝癌［4］細胞均有一定的抑制增殖作用。故本文以大黃酸為母體化合物，接入腫瘤增殖中大量需要的氨基酸，希望能從中尋找到具有較好放射增敏活性且低毒副作用的放射增敏劑。由于大黃酸和所得的大黃酰氨基酸在水和脂性試劑中均不溶，所以將它們都轉換成鈉鹽，改善水溶性，以期達到更好的抗腫瘤活性。結果顯示，大黃酸鈉和所得的大黃酰氨基酸鈉鹽表現出明顯的時間和濃度依賴性抗癌活性。與大黃酸鈉相比，大黃酰亮氨酸鈉和大黃酰異亮氨酸鈉對H460 細胞的IC50值更小，說明有更強的抑制增殖的作用。而其他大黃酰氨基酸鈉鹽并無此表現。甚至在測定大黃酰色氨酸鈉24、48 h 和大黃酰脯氨酸鈉48 h 時，低濃度可顯著地促進增殖。

初步的放射增敏結果顯示，在相應化合物的48 h IC15和IC20濃度，陽性對照表柔比星有明顯的放射增敏作用，大黃酰異亮氨酸也已表現出放射增敏作用，而大黃酸鈉和大黃酰亮氨酸鈉沒有顯示出放射增敏作用。但這只是初步完成了放射增敏測定，后續還需克隆形成實驗進一步驗證結果。

1 Gao CL(高春玲)，Gao CL(高春麗)，Song WF(宋維芳)，et al.放射增敏劑的增敏機制.J Mod Oncol(現代腫瘤醫學)，2007，15:890-892.

2 Peng F(彭芳)，Chen M(陳明).抗血管生成和腫瘤血管正常化的研究進展.Chin J Lung Cancer(中國肺癌雜志)，2009，12:799-804.

3 Chang CY，Chan HL，Lin HY，et al.Rhein induces apoptosis in human breast cancer cells. Evid Based Complement Alternat Med，2012，Accepted.

4 Shi P，Huang Z，Chen G. Rhein induces apoptosis and cell cycle arrest in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells.Am J Chin Med，2008，36:805-813.

5 Chen YY，Chiang SY，Lin JG，et al.Emodin，aloe-emodin and rhein inhibit migration and invasion in human tongue cancer SCC-4 cells through the inhibition of gene expression of matrix metalloproteinase-9.Int J Oncol，2010，36:1113-1120.

6 Fernand VE，Losso JN，Truax RE，et al.Rhein inhibits angiogenesis and the viability of hormone-dependent and -independent cancer cells under normoxic or hypoxic conditions in vitro.Chem Biol Interact，2011，192:220-232.

7 Lin YJ，Zhen YS. Rhein lysinate suppresses the growth of breast cancer cells and potentiates the inhibitory effect of Taxol in athymic mice. Anticancer Drugs，2009，20(1):65-72.

8 Ip SW，Weng YS，Lin SY，et al.The role of Ca+2 on rheininduced apoptosis in human cervical cancer Ca Ski cells.Anticancer Res，2007，27:379-389.

9 Ge X，Luo X，Chen Y，et al.Rhein induces apoptosis of HCT-116 human colon cancer cells via activation of the intrinsic apoptotic pathway.African J Biotech，2011，10:13244-13251.

10 Lin ML，Chen SS，Lu YC，et al. Rhein induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress and Ca2+-dependent mitochondrial death pathway in human nasopharyngeal carcinoma cells. Anticancer Res，2007，27:3313-3322.