麥冬抑制大鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的作用及其機(jī)制*

王國(guó)欽， 李瑞滿， 金 偉， 宋國(guó)良， 陳 勤， 裴兆輝△

(南昌市第三醫(yī)院1中醫(yī)科，3心內(nèi)科，江西 南昌330009;2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州510632)

心肌纖維化過(guò)程中，心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)異常聚集在心肌間質(zhì)和血管周圍。心肌纖維化可引起心肌結(jié)構(gòu)紊亂，僵硬度增加，心臟順應(yīng)性降低，心律失常以及頑固性心衰的發(fā)生率增高，它是心血管疾病共同病理生理過(guò)程，是心肌缺血、心律失常以致心源性猝死的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［1-2］。麥冬(Ophiopogon japonicus)是百合科植物，具有養(yǎng)明清熱、潤(rùn)肺止咳的功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為麥冬具有強(qiáng)心、利尿、抗菌等作用。目前麥冬抗肺纖維化作用報(bào)道較多，但麥冬抗心肌纖維化的報(bào)道較少。本課題觀察中藥麥冬在大鼠心肌成纖維細(xì)胞的影響，并探討其機(jī)制，為心肌纖維化的防治提供理論指導(dǎo)及實(shí)驗(yàn)支持。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動(dòng)物 出生1 ～3 d 的SD 大鼠，由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑 兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、p-Smad2/3 和Smad2/3抗體購(gòu)于Cell Signaling。中藥麥冬購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

2 方法

2.1 麥冬水提液制備 將麥冬若干株，先用自來(lái)水洗凈植株地上部分的灰塵及根部的泥土，再用蒸餾水沖洗若干次，在室內(nèi)自然晾干。將麥冬地上部分和地下部分分別剪成5 cm 左右的小段，各取新鮮植物200 g 加蒸餾水2 000 g，充分搖勻后放置于密封容器內(nèi)浸泡48 h，雙層紗布過(guò)濾2 次后即得麥冬地上部分和地下部分水提原液(0.1 kg/L)，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?］。

2.2 大鼠CFs 的培養(yǎng)與鑒定

2.2.1 大鼠CFs 的培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取出新生SD大鼠心臟，去除心房和大血管。PBS 漂洗后，將心室部分剪至0.5 ～1.0 mm3小塊，0.125 g/L 胰蛋白酶37 ℃消化30 ～40 min，每10 min 收集1 次細(xì)胞，收集3 ～4 次，篩網(wǎng)過(guò)濾后1 000 r/min 離心5 min，將所得細(xì)胞分散懸浮于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2孵箱中靜置貼壁60 ～90 min，傾去上層未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液。心肌成纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞貼壁速度快，培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞基本為成纖維細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)3 d，細(xì)胞生長(zhǎng)至近匯合狀態(tài)時(shí)按1∶3 傳代。實(shí)驗(yàn)采用3 ～4 代細(xì)胞。若細(xì)胞貼壁并已伸展但未匯合，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢查活細(xì)胞數(shù)＞95%，則換成無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.2.2 大鼠CFs 的鑒定 倒置顯微鏡下可見(jiàn)CFs呈梭形、多角形，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，見(jiàn)圖1。臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞大于95%。

Figure 1. Cultured rat CFs under reverse microscope (×250).圖1 倒置顯微鏡下培養(yǎng)的鼠CFs

2.3 細(xì)胞活力分析 將刺激后的細(xì)胞置于37 ℃飽和濕度、95%空氣、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，消化1 mL 細(xì)胞懸液后置于Vi-CELL AUTO 100/240 細(xì)胞活力分析儀中進(jìn)行分析。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組及檢測(cè)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)分4 組:對(duì)照組:只加無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液;麥冬干預(yù)組:麥冬加入無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液中。檢測(cè)［3H］-脯氨酸摻入率、TGF-β1、p-Smad2/3 和Smad2/3 的表達(dá)。

2.5 ［3H］-脯氨酸摻入實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞膠原合成能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5 ×103cells/well 接種在96 孔板中。饑餓期結(jié)束后，加入無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液、不同濃度糜酶或糜酶抑制劑作用24 h;或給予各干預(yù)藥物預(yù)處理1 h，再分別與30 g/L 糜酶共同作用24 h。每孔加入［3H］脯氨酸(購(gòu)自中國(guó)原子能研究院同位素研究所)111GBq 和維生素C 50 mg/L 繼續(xù)孵育4 h。用25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞呈細(xì)胞懸液，多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞至玻璃纖維濾紙上，烤干。將玻璃纖維濾紙置于閃爍計(jì)數(shù)管中，每管加入閃爍液5 mL，液態(tài)閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定放射性強(qiáng)度。

2.6 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞TGF-β1、p-Smad2/3和Smad 的蛋白表達(dá) 將細(xì)胞以5 ×104cells/well 接種在6 孔板中。加入無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液或40 g/L麥冬作用24 h。收獲細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min;離心10 min，上清部分保存于-80 ℃，用于測(cè)定胞漿TGF-β1和Smad2/3 蛋白表達(dá)。上清液中的蛋白濃度以BCA 法測(cè)定。取等量蛋白與加樣緩沖液混合，煮沸5 min，上樣，行SDS-PAGE 凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫封閉1 h，分別加入兔抗大鼠TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3 和β-actinⅠ抗，過(guò)夜，洗膜，再加入HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h，暗室中用ECL 覆蓋膜5 min，X 光膠片曝光，顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行分析，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。對(duì)細(xì)胞活力儀所得數(shù)據(jù)進(jìn)行析因方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CFs 細(xì)胞活力分析

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。低濃度麥冬處理組和高濃度麥冬處理組比較，組間細(xì)胞活力隨著濃度升高，不同濃度組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度麥冬對(duì)心臟成纖維細(xì)胞活力的影響Table 1. The effects of Ophiopogon japonicus on the vitality of cardiac fibroblasts (mean±SD.n=10)

2 麥冬對(duì)CFs 的［3H］-脯氨酸摻入率的影響

［3H］-脯氨酸摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10、20 和30 μg/L 麥冬作用24 h，心臟成纖維細(xì)胞 的［3H］-脯氨酸摻入率呈遞減趨勢(shì)。10 μg/L 麥冬組［3H］-脯氨酸摻入率顯著低于對(duì)照組(P ＜0.01);20 μg/L 麥冬組［3H］-脯氨酸摻入率顯著低于10 μg/L 麥冬組(P＜0.01);30 μg/L 麥冬組［3H］-脯氨酸摻入率顯著低于20 μg/L 麥冬組(P ＜0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The effects of Ophiopogon japonicus on［3H］-proline incorporation in cardiac fibroblasts. Mean ± SD. n =10. * P ＜0.05 vs control;## P ＜0.01 vs 10 μg/L Ophiopogon japonicus;△△P ＜0.01 vs 20 μg/L Ophiopogon japonicus.圖2 不同濃度麥冬對(duì)心臟成纖維細(xì)胞［3H］-脯氨酸摻入率的影響

3 麥冬對(duì)CFs 的TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

Western blotting 結(jié)果顯示，在30 μg/L 麥冬作用下，TGF-β1蛋白表達(dá)呈濃度依賴性改變。10 μg/L麥冬組TGF-β1蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P ＜0.01);20 μg/L 麥冬組TGF-β1蛋白表達(dá)顯著低于10 μg/L 麥冬組(P ＜0.01);30 μg/L 麥冬組TGF-β1蛋白表達(dá)顯著低于20 μg/L 麥冬組(P ＜0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The effects of Ophiopogon japonicus on TGF-β1 protein expression in cardiac fibroblasts.Mean±SD.n=10.* P ＜0.05 vs control;##P ＜0.01 vs 10 μg/L Ophiopogon japonicus;△△P ＜0.01 vs 20 μg/L Ophiopogon japonicus.圖3 麥冬作用不同時(shí)間對(duì)大鼠心臟成纖維細(xì)胞TGF-β1 蛋白表達(dá)的影響

4 麥冬對(duì)CFs 的Smad 蛋白表達(dá)的影響

Western blotting 結(jié)果顯示，在30 μg/L 麥冬作用下，p-Smad2/3 及Smad2/3 蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性改變。10 μg/L 麥冬組p-Smad2/3 及Smad2/3 蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P ＜0.01);20 μg/L 麥冬組p-Smad2/3 及Smad2/3 蛋白表達(dá)顯著低于10 μg/L麥冬組(P ＜0.01);30 μg/L 麥冬組p-Smad2/3 及Smad2/3 蛋白表達(dá)顯著低于20 μg/L 麥冬組(P ＜0.01)，見(jiàn)圖4。

討 論

心肌纖維化近年來(lái)日益受到國(guó)內(nèi)外心血管專家的重視，目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明［4-5］。雖然目前血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑類藥物已廣泛用于臨床，但其它的藥物目前尚無(wú)明顯的證據(jù)顯示可以改善心肌纖維化。中藥麥冬近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)具有抗心肌纖維化的作用，但該藥物能否有效改善心肌纖維化還有待進(jìn)一步證實(shí)，其作用機(jī)制也需要進(jìn)一步闡明。

Figure 4. The effects of Ophiopogon japonicus on Smad protein expression in cardiac fibroblasts. Mean ± SD. n =10.* P ＜0.05 vs control;##P ＜0.01 vs 10 μg/L Ophiopogon japonicus;△△P ＜0.01 vs 20 μg/L Ophiopogon japonicus.圖4 麥冬對(duì)大鼠心臟成纖維細(xì)胞Smad 蛋白表達(dá)的影響

脯氨酸是心肌膠原合成的重要底物，測(cè)定［3H］-脯氨酸摻入率可準(zhǔn)確反映心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的能力［3］。本研究結(jié)果表明，中藥麥冬能夠抑制心肌成纖維細(xì)胞活力和［3H］-脯氨酸摻入率，表明中藥麥冬可抑制心肌成纖維細(xì)胞活力和膠原合成，從而抑制心肌纖維化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，麥冬預(yù)處理組細(xì)胞活力和［3H］-脯氨酸摻入率明顯降低，而且麥冬的抑制作用與其濃度明顯相關(guān)。在體外培養(yǎng)中，TGF-β1以無(wú)活性的形式被釋放，激活后促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞分化增生，上調(diào)膠原合成并抑制膠原酶釋放。在成纖維細(xì)胞內(nèi)，TGF-β1能增強(qiáng)脯氨酸羥化，使產(chǎn)生的原膠原分子更為穩(wěn)定而難以降解［6］。目前關(guān)于中藥麥冬抑制心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。TGF-β1是眾多因素導(dǎo)致組織纖維化的最后共同通路之一［7］。本研究結(jié)果顯示，麥冬以濃度依賴方式抑制TGF-β1蛋白表達(dá)，表明TGF-β1參與麥冬抑制心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的作用。TGF-β1是成纖維細(xì)胞的強(qiáng)趨化因子，誘導(dǎo)其分化為心肌成纖維細(xì)胞，刺激膠原蛋白、纖維連接蛋白及蛋白多糖等細(xì)胞間質(zhì)成分的合成，促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)的沉積。

Smad 蛋白是TGF-β1下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子［8］。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，Smad 蛋白可分為3個(gè)亞家族:受體激活型Smads(R-Smads)、共同介質(zhì)型Smads(Co-Smads)和抑制型Smads(I-Smads)［7］。介導(dǎo)TGF-β1信號(hào)的R-Smads 主要是Smad2 和Smad3，可被TGF-β1的受體磷酸化而激活，形成p-Smad2 和p-Smad3。后者進(jìn)一步與Co-Smads 結(jié)合成為轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，移入細(xì)胞核內(nèi)，激活特定的靶基因，完成細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。p-Smad2/3 是由Smad2/3 磷酸化而來(lái)，是Smad2/3 的活化形式［9-11］。在本實(shí)驗(yàn)中，Western blotting 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，在麥冬作用下，p-Smad2/3 及Smad2/3 蛋白表達(dá)呈濃度依賴性改變，中藥麥冬可以抑制p-Smad2/3 及Smad2/3 蛋白表達(dá)，表明Smad 信號(hào)通路的活化參與麥冬調(diào)控心肌纖維化過(guò)程。

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