5-Aza-dC對(duì)Molt-4細(xì)胞RASSF10基因啟動(dòng)子的去甲基化作用

汪 茗， 章 堯， 謝向榮， 劉善浩， 戚之琳， 畢富勇

(1.皖南醫(yī)學(xué)院生化教研室， 蕪湖 241002; 2.弋磯山醫(yī)院心內(nèi)科，蕪湖 241001; 3.弋磯山醫(yī)院血液內(nèi)科， 蕪湖 241002)

DNA甲基化異常作為一種表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，是細(xì)胞癌變過(guò)程中的早期、頻發(fā)事件，并且是一個(gè)可逆的生物學(xué)過(guò)程。因此甲基化的特異基因可作為腫瘤早期診斷、治療的分子標(biāo)志，而對(duì)特異基因進(jìn)行去甲基化處理則可以達(dá)到治療腫瘤的目的[1-2]。RASSF10是最近鑒定出的RASSF家族的新成員[3]。已有報(bào)道提示RASSF10的啟動(dòng)子甲基化在甲狀腺癌、前列腺癌[3-4]等腫瘤中頻繁出現(xiàn)。本研究以人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Molt-4細(xì)胞為研究對(duì)象，采用MTT、RT-PCR、Western blot、COBRA等方法研究甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′deoxycytidine，5-Aza-dC)對(duì)Molt-4細(xì)胞的增殖、RASSF10 mRNA、蛋白表達(dá)及RASSF10基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Molt-4細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所。

1.1.2 試劑 5-Aza-dC購(gòu)自Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；RNA提取、RT-PCR試劑盒購(gòu)自TAKARA公司；基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；DNA甲基化試劑盒購(gòu)自Millipore公司；DNA marker 及引物均購(gòu)自上海生工公司；RASSF10多克隆抗體購(gòu)自Abgent公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，將Molt-4細(xì)胞置于37℃，5% CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 MTT(四唑鹽比色法) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×105/mL，接種于96孔板。5-Aza-dC作用24、48、72 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL, 37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心棄上清，加DMSO 150 μL,震蕩后酶標(biāo)儀570 nm下測(cè)定各孔的吸光度A，按下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn))/A對(duì)照×100%

1.2.3 RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 5-Aza-dC作用72 h后，Trizol提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度(A260/A280>1.8)。兩……