FISH技術解析不同氨氮濃度MBR中的微生物群落結構

楊小麗 周 娜 陳 明 張 瑞 宋海亮 傅大放

(1東南大學土木工程學院,南京 210096)

(2東南大學能源與環境學院,南京 210096)

膜生物反應器(membrane bioreactor,MBR)是將生物處理與膜分離技術有機結合起來的一種新型污水處理技術．由于膜組件的高效截留作用,MBR實現了水力停留時間(HRT)和污泥齡(SRT)的完全分離,有利于世代周期較長的硝化細菌的富集增長,使MBR硝化效率增強,但目前對不同硝化強度下MBR中起主要作用的微生物群落結構的變化研究仍較有限[1]．近年來,隨著PCR,SSCP,FISH等現代分子生物技術的發展,使得快速準確地鑒定細菌成為可能．在水處理微生物學中,已經開始廣泛應用現代生物學分子技術檢測處理體系中微生物群落生態演替規律及種群數量的波動等．其中,FISH是應用廣泛、最為有效的技術之一．

為了探究不同硝化過程中微生物群落結構的組成變化,本文應用FISH技術對不同氨氮負荷的MBR進行微生物種群檢測．根據文獻[2-3],本文選擇了污水處理中常見的8種細菌并對其數量進行檢測分析,分別是:變形菌(α-變形菌(Alphaproteobacteria)、β-變形菌(Betaproteobacteria)、γ-變形菌(Gammaproteobacteria))、放線菌、黃桿菌、綠彎菌、氨氧化細菌、硝化細菌．通過研究,以期真實反映出在不同進水氨氮濃度的MBR中微生物群落結構的組成變化,同時分析其數量分布及豐度,探索MBR中微生物菌群結構與硝化作用的內在關系,為實際工程進一步提高MBR的處理效果提供理論依據．

1 實驗方法

1.1 實驗裝置

MBR實驗裝置如圖1所示．

圖1 MBR實驗裝置示意圖

1.2 熒光原位雜交技術實驗步驟

熒光原位雜交技術實驗步驟如下：① 進行玻片預處理、樣品采集與預處理[4]．② 雜交反應.在密閉的雜交盒中放入吸水紙,用不含探針的雜交液(SDS 0.1%,Tris-HCl (pH 8.0) 20 mmol/L,甲酰胺濃度見表1)潤濕．用移液槍分別取24 μL雜交液和1 μL探針溶液放入帶有樣品的載玻片上,然后放入雜交盒內進行雜交反應．總細菌和硝化細菌雜交時間為5 h,其余為2～3 h,雜交溫度均為46 ℃．所有有關探針的操作應避光處理．③ 洗脫反應.提前將洗脫液(EDTA 56 mmol/L,SDS 0.1%,Tris-HCl (pH 8.0) 20 mmol/L,NaCl濃度根據雜交液中甲酰胺濃度確定)放入水浴鍋中48 ℃預熱,然后倒入干燥的雜交盒;將載玻片放入裝有洗脫液的雜交盒中,避光密閉洗脫20 min后除去洗脫液,用ddH2O漂洗2次．④ DAPI染色.取10 μL濃度為1 μg/mL的DAPI加到載玻片樣品上,染色5 min,用甲醇漂洗,加上蓋玻片,用封片劑封片,放在室溫下晾干．

表1 實驗使用的16S和23S rRNA特異寡核苷酸探針序列

待載玻片干燥后,立即使用OLYMPUS-BX41熒光顯微鏡觀察．該熒光顯微鏡配置有3種不同波長的濾光片,分別為:395～415 nm,420～485 nm,460～550 nm．觀測30個視野,用Image-Pro Plus 6.0軟件讀取細菌數目．對每個樣品進行了3組平行實驗．觀察時每組實驗至少攝取30個視野進行計數，然后將3組平行樣的計數結果進行平均計算[8]．

本實驗所使用的靶向細菌、序列、雜交條件詳見表1．其中探針NIT3用FITC標記,激發光為亮綠色;其余探針用HEX標記,激發光為紅色．

2 實驗結果與討論

2.1 MBR對污染物的去除效果

表2 MBR對COD和的平均去除效果(n=33)

2.2 MBR微生物群落結構

圖2為3個MBR中細菌的構成比較．由圖可看出,3個MBR中,所選細菌涵蓋細菌總量的90%～97%,說明所選細菌具有很好的代表性[12]．在1#MBR中α-變形菌和β-變形菌相對系統中其他細菌來說含量較多,占總細菌的比例分別為18%和21%;其次是氨氧化細菌、硝化細菌、γ-變形菌和綠彎菌,分別占總細菌的15%,13%,12%和10%;放線菌和黃桿菌相對來說含量較低,均不超過6%;另外,3%的細菌未檢測出．Zang等[13]采用FISH方法測試了活性污泥中的優勢菌群，得出類似的結果:α-變形菌和β-變形菌占總細菌的比例均為20%左右；黃桿菌和放線菌相對含量為6%～10%．在2#MBR中優勢菌群是β-變形菌,占總細菌數量的比例為24%;其次是α-變形菌、放線菌、黃桿菌和綠彎菌,占總細菌的比例為15%左右;其余細菌所占比例均不大于5%．在3#MBR中氨氧化細菌為絕對優勢菌種,占總細菌的26%;其次是α-變形菌、硝化細菌和β-變形菌,所占比例分別為19%,17%和16%;其他細菌所占比例約為2%～5%．以上結果表明,不同進水氨氮濃度的MBR經過長時間的穩定運行后,形成了各自特定的微生物群落結構,相同的微生物種群在不同的MBR體系中的優勢地位不同．

圖2 3個MBR中細菌的構成比較

從圖2中還可看出,變形菌在3個MBR中占總細菌的比例分別是51%,44%,39%,可見變形菌在MBR微生物群落結構中占有明顯優勢．張斌等[14]采用PCR-DGGE技術對處理不同廢水MBR體系中的微生物群落結構比較也發現,變形菌是MBR的主要優勢菌落．

圖3是MBR中微生物的熒光顯微圖像．圖3(f)為綠彎菌,在3個MBR中含量均比較少．Bj?rnsson等[10]實驗證明,綠彎菌確實是活性污泥的組成成分之一．在活性污泥系統中綠彎菌是生活在好氧環境下的,主要以糖類為基質[15-16]，因此較低氨氮負荷的MBR更有利于綠彎菌的生存．Kragelund等[16]應用MAR-FISH技術對126座生活污水和工業廢水處理廠進行的綠彎菌檢測表明,50%的污水廠中檢測到了綠彎菌,其中12%的污水廠中綠彎菌含量比較高,而且是造成污泥膨脹的主要絲狀細菌之一．

圖3(g)、(h)在同一個視野下拍攝的,圖3(g)是2#MBR的熒光顯微圖像,圖3(h)是2#MBR β-變形菌的DAPI圖像,箭頭指向的是該探針檢測到的β-變形菌．由圖可看到,這種細菌在2#MBR中呈絲狀大量分布．此時，2#MBR中放線菌和綠彎菌較其他2個MBR含量增多,與2#MBR呈現污泥膨脹的態勢相吻合．由此表明,低氨氮負荷的MBR在長期穩定運行中更易發生污泥膨脹,絲狀β-變形菌是引起污泥膨脹的主要絲狀細菌之一．

黃桿菌熒光顯微圖像如圖3(j)所示,在2#MBR中的含量也相對較高．這可能是由于2#MBR中有機物(投加的主要是葡萄糖)濃度相對氨氮濃度較高,有利于黃桿菌這類主要以葡萄糖作為碳源和能源,且極少能利用其他碳源生長的細菌生存[16]．

2.3 微生物群落結構與污染物去除效果的相關性分析

表3 微生物群落結構與污染物去除效果的相關性分析

圖3 MBR穩定運行條件下體系中微生物熒光顯微圖像(視野放大倍數是1 000倍)

3 結論

1) 進水氨氮濃度不同的MBR經過長時間的穩定運行,各自形成了特有的微生物群落結構,并且相同的微生物種群在不同運行條件的MBR系統中的優勢地位也不相同,變形菌是MBR主要優勢菌群之一．

2) 高進水氨氮濃度的MBR為氨氧化細菌和硝化細菌提供了有利的生存條件,使這些細菌在MBR系統中大量繁殖富集,提高了MBR的硝化能力．低進水氨氮濃度的MBR限制了氨氧化細菌和硝化細菌的生存,在與其他細菌的競爭中,逐漸被淘汰,且低氨氮負荷下,MBR系統中存在大量的β-變形菌、放線菌、綠彎菌等絲狀菌．

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