酶聯免疫法檢測動物源性食品中甲羥孕酮的殘留

張立新，馮才偉，賈芳芳 ，劉玉梅，楊 爍

（1.北京市優質農產品產銷服務站，北京 100101；2.北京勤邦生物技術有限公司，北京 102206）

甲羥孕酮又稱甲孕酮，是一種長期避孕藥，也可用于一些對激素敏感腫瘤的姑息治療；魚類會因為水中微量的甲羥孕酮而改變性別。人食用含有甲羥孕酮的動物源性食品后，會擾亂人體內分泌、生長發育、免疫系統、生殖系統等方面的正常功能，還可能致癌、致畸，因此建立檢測動物源性食品中甲羥孕酮殘留的方法很有必要。目前，檢測該類藥物的方法主要是儀器法，但其資金、人員等成本投入較高，不宜推廣。本試驗運用酶聯免疫檢測法，測定了雞肉和魚肉中甲羥孕酮的殘留量，旨在尋找成本更低的替代檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 甲羥孕酮ELISA檢測試劑盒（包含96孔酶標板，甲羥孕酮標準品，酶結合物，底物液、終止液、洗滌液、復溶液），購自北京某生物技術有限公司；氫氧化鈉、乙腈等購自北京某試劑公司；雞肉、魚肉樣品購自超市；酶標儀購自上海某分析儀器有限公司，渦旋儀、均質器購自湖南某科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理。用均質器均質肉組織樣本；稱取（3.0±0.05）g均質物至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入6mL乙腈-0.1mol/L氫氧化鈉溶液，渦動2min，4 500 r/min以上，室溫離心5min；取出1mL上清液至15mL干凈的玻璃試管中，于50～60℃氮氣流下吹干；加入1mL復溶液，用渦旋儀渦動1 min，然后取100 μL加入到 900 μL復溶液中，混勻；最后取50 μL 用于檢測。

1.2.2 檢測步驟。取出所需數量的微孔板，將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做兩孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置；加標準品或樣本50 μL到對應的微孔中，然后加入酶結合物（50 μL/孔），輕輕振蕩、混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應30 min；小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌液（250μL/孔），充分洗滌4～5次，每次間隔10s，倒出板孔內的洗滌液，用吸水紙拍干；加入底物液A液（50μL/孔），再加入底物液 B 液（50 μL/孔），輕輕振蕩、混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應15 min；加入終止液（50μL/孔），輕輕振蕩、混勻，設定酶標儀于450nm處測定每孔的吸光度值（OD值）。

1.2.3 百分吸光率的計算。標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準品（0標準）的吸光度值的平均值,再乘以100%，即

式中：B——標準品或樣本溶液的平均吸光度值；

B0——0μg/L標準溶液的平均吸光度值。

以標準品百分吸光率為縱坐標，甲羥孕酮標準品濃度的對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中甲羥孕酮的實際濃度。

2 結果與分析

2.1 標準曲線 根據1.2.2步驟，分別測定濃度為0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 μg/L 甲羥孕酮標準液的吸光度值，建立標準曲線。詳見表1、圖1和圖2。

表1 標準曲線的ELISA測定

圖1 甲羥孕酮標準曲線圖

圖2 標準曲線方程

試驗表明，標準曲線的質量濃度范圍在0.03～0.48μg/L，IC50（50%抑制濃度）為83.0μg/L；線性方程y=-2.1773x+1.5218，R2=0.9938。

2.2 檢測限 對20份空白雞肉和20份空白魚肉樣本進行檢測，從標準曲線上查出對應于各百分吸光率的濃度。以20份樣本甲羥孕酮濃度的平均值（x）和標準差（s）表示檢測限（MDL），即 MDL=x+3s。結果顯示，該酶聯免疫法對雞肉和魚肉樣本的檢測限均為1μg/kg。

2.3 準確度和精密度 酶聯免疫法的準確度用回收率表示，精密度用變異系數表示。在空白雞肉和魚肉樣本中添加濃度為1、2、4μg/kg的甲羥孕酮，用3個批次的ELISA試劑盒進行回收試驗，每個添加量做4個平行，結果見表2、表3。

表2 雞肉樣本精密度及準確度試驗

表3 魚肉樣本精密度及準確度試驗

從表2、表3可見，對雞肉樣品進行添加，甲羥孕酮的平均回收率在68.3%～94.6%之間；對魚肉樣品進行添加，其平均回收率在65.5%～93.2%之間；兩個樣本的批內、批間相對標準偏差（RSD）均小于10%。

2.4 交叉反應率試驗 根據交叉反應率公式，計算得到甲羥孕酮試劑盒與甲地孕酮、孕酮、己烯雌酚、炔諾酮的交叉反應率均小于1%，說明該酶聯免疫試劑盒的特異性較高。結果見表4。

表4 交叉反應率試驗

2.5 儀器法比對試驗 取50份雞肉和魚肉樣本，用“SN/T 1625-2005進出口動物源性食品中甲羥孕酮和醋酸甲羥孕酮殘留量的檢測方法：氣相色譜-質譜測定方法”進行儀器對比試驗，結果顯示該儀器法的檢測限為1μg/kg。表明本次試驗所用試劑盒的檢測結果和儀器法的檢測結果是一致的。詳見表5、表6。

表5 雞肉樣本的酶聯免疫法和儀器法對比試驗 μg/kg

表6 魚肉樣本的酶聯免疫法和儀器法對比試驗 μg/kg

3 結論

酶聯免疫法對雞肉和魚肉樣本的檢測限均為1 μg/kg。當甲羥孕酮的添加濃度為 1、2、4μg/kg時，其平均回收率范圍在65.5%～94.6%；交叉反應率試驗表明該試劑盒的特異性良好；酶聯免疫法與儀器法的驗證結果一致。由于某些不可避免的人為誤差，不同批次的ELISA試劑盒在制作過程中很難保證質量完全一致，而本試驗所用甲羥孕酮檢測試劑盒的批內、批間相對標準偏差均小于10%，重現性較好。該酶聯免疫法的操作時間短，靈敏度較高，檢測限低，不需要昂貴的儀器設備，操作方法較簡單，因此適合現場大批量檢測樣本的快速檢測。

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