HPLC法測定平胃散中聚乙炔類成分

徐敬儒 劉玉強 才 謙

遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600

平胃散最早記載于《簡要濟眾方》，后完備于《太平惠民和劑局方》卷3[1]，其功效燥濕健脾，行氣和胃。主治濕困脾胃癥。處方由君藥蒼術（麩炒）配以厚樸（姜炙）、陳皮、甘草4味組成，為全面提高藥品質量標準，保證臨床用藥安全、有效，本實驗采用高效液相色譜法對平胃散中的蒼術素和（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯兩種聚乙炔類成分進行了含量測定。

1 材料與方法

1.1 儀器

手提式粉碎機（浙江中藥機械有限公司）；Sartorius CP225D型電子天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）；AR2140電子分析天平（上海奧豪斯公司）；KH-300P型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；高效液相色譜儀為Angilent 1100系列：四元泵、在線脫氣機、柱溫箱、Angilent 1100化學工作站；Promosil C18（4.6mm×250mm,5μm）色譜柱（Bonna-Agela technologies）。

1.2 試劑和藥材

蒼術素和(4E,6E,12E)-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯峰對照品（上海中藥標準化研究中心，純度大于98%）；乙腈(色譜純，瑞典歐森巴克化學公司)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；其余試劑均為分析純；蒼術（麩炒）、厚樸（姜炙）、陳皮、甘草（炙）均購自北京同仁堂大藥房大連分店，經遼寧中醫藥大學鑒定教研室李峰教授鑒定，均符合《中國藥典》規定。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取蒼術素和（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯峰對照品適量，加甲醇配成質量濃度分別為497mg/L和502mg/L的儲備液；不同濃度的對照品溶液的配制均用以上儲備液混合并用甲醇稀釋，定容，微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得對照品混合溶液。以上溶液均密封避光保存備用。

2.2 供試品溶液的制備

取蒼術24g，厚樸18g，陳皮12g，甘草6g，四種藥材混合粉碎(過60目篩)去，取約0.5g，精密稱定，置于具賽錐形瓶中，加入甲醇20mL，密塞，超聲提取60min，取出，放至室溫后濾過，濾液經減壓旋蒸濃縮后，移至5mL量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，靜置。取溶液過0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液備用，整個過程要求避光。

2.3 陰性液的制備

取厚樸18g，陳皮12g，甘草6g，三種藥材混合粉碎(過60目篩)去，取約0.5g，精密稱定，置于具賽錐形瓶中，加入甲醇20mL，密塞，超聲提取60min，取出，放至室溫后濾過，濾液經減壓旋蒸濃縮后，移至5mL量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，靜置。取溶液過0.45μm微孔濾膜，作為陰性對照溶液備用，整個過程要求避光。

2.4 色譜條件

色譜柱 promosll-C18（4.6mm×250mm,5μm）；流速：1.0mL/min，柱溫：25℃；檢測波長：340 nm；進樣量為20μl；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序：48%A（8min）-54%A（7 min）-85%A（13 min）。理論塔板數以蒼術素計不低于8000，以（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯峰計不低于8000。

3 結果

3.1 系統適應性試驗

取陰性對照溶液、二合一對照品溶液和供試品溶液，按2.4項色譜條件下進樣，其色譜圖如圖1所示陰性樣品溶液在蒼術素與（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯對應保留時間的出峰位置處無干擾。色譜圖，見圖1。

圖1 陰性對照品、二合一對照品和樣品的HPLC圖譜

3.2 線性關系考查

精密吸取蒼術素和(4E,6E,12E)-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯峰對照品溶液適量，加甲醇配制成不同濃度的溶液，按2.4項下所述色譜條件下，以標準品濃度為橫坐標，以峰面積積分值縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表1。

表1 兩種聚乙烯類成分的準曲線方程、相關系數和線性范圍

3.3 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液20μL，按2.3項下所述色譜條件下進樣，連續進樣6次，蒼術素峰面積的RSD為1.5%（n=6）；（4E，6E，12E）- 十四癸三烯 -8,10- 二炔 -1,3- 二乙酸酯峰面積的RSD為1.7%（n=6）。

3.4 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液20μL，按2.3項下所述色譜條件下進樣，分別在 0、4、8、12、24、36 h 注入液相色譜儀測定，蒼術素峰面積峰面積的RSD為2.4%（n=6）；（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯峰面積的RSD為3.7%（n=6）。表明供試品溶液在36h內穩定。

3.5 重復性試驗

取同一批號藥材粉末，平行稱定6份，按2.2項下所述方法制備供試品溶液，按2.4項下所述色譜條件下進樣，測定峰面積并計算含量，結果表明，樣品中蒼術素的平均質量 分 數 為 1.45mg/g，RSD為 2.8%（n=6）；（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯的平均質量分數為2.88mg/g，峰面積的RSD為3.6%（n=6）。

3.6 加樣回收率試驗

取已測定含量的平胃散藥材粉末約0.25g，精密稱定6份，加入適量對照品，按2.2項下所述方法制備供試品溶液，按2.4項下所述色譜條件下進樣分析，測定峰面積并計算含量、回收率和RSD，結果見表2。

表2 平胃散中2種聚乙炔類化合物回收率試驗結果（n=5）

3.7 樣品含量測定

取平胃散藥材粉末6批，按2.2項下所述方法制備供試品溶液，按2.4項下所述色譜條件下進樣分析，計算蒼術素和（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯的含量，結果見表3。采用本法測得（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯的平均含量2.823mg/g，蒼術素的平均含量1.444mg/g。

表3 平胃散中2種聚乙炔類化合物的含量（mg/g，n=6）

4 討論

蒼術素、蒼術素醇和（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1，3-二乙酸酯均屬于聚乙炔類化合物，且該類化合物在利膽、抗炎、消化道系統以及阻礙黃嘌呤氧化酶等方面體現良好活性[2-3]。該類化合物主要存在于蒼術中，含量較高，同屬植物白術中幾乎不含有該類成分[4]，且已有利用HPLC法測定二妙丸中蒼術素含量的相關研究[5]，故選用聚乙炔類化合物作為以蒼術為君藥的復方制劑平胃散的專屬性測定成分具有合理性，但因蒼術素醇化學性質較不穩定，易分解，因此以蒼術素和（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1，3-二乙酸酯為指標，建立其含量測定方法更為合理。

供試品制備曾分別以甲醇超聲0.5、1、2h，結果采用超聲1h和2h提取的聚乙炔類含量較完全，且結果相差不大，故選用以甲醇超聲提取，同時考察發現超聲1h有效成分方可提取完全，故確定此提取時間。

在波長選擇過程中，將（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8、10-二炔-1、3-二乙酸酯對照品溶于甲醇中，測定其紫外光譜，發現在320nm附近有較大吸收，紫外光譜圖見圖2。根據文獻報道，蒼術素的最大吸收波長為340nm[6-7]，且參考中國藥典[8]規定蒼術素的檢測波長為340nm，為方便檢測，故最終確定檢測波長為340nm。

流動相選擇上，由于平胃散成分較為復雜，對液相檢測有較大干擾，本實驗先后比較了乙腈-水( 70∶30) 、甲醇-水（79∶21）等不同比例等度洗脫，結果表明等度洗脫很難保證在相對較短的保留時間內使兩種聚乙炔類化合物達到較高的分離度，故采用梯度洗脫，其優點在于：色譜峰分離度好，保留時間適中。

[1] 吳建紅 .簡述平胃散源流發展 [J].湖北中醫學院學報，1999，1（2）：19-20.

[2] Resch M，Heilmann J，Steigel A，Bauer R.Planta Med,2001,67（5）：437.

[3] Sakurai T,Sugawara H,Salto K I,Kano Y.Phytother Res,1995,9（5）：340.

[4] 陳炎明，侴貴新，王崢濤.反相高效液相色譜法同時測定蒼術中的兩種聚乙炔類化合物 [J].色譜，2007，1（25）：84-87.

[5] 王琰.HPLC測定二妙丸中蒼術素[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（24）：65-66.

[6] 張曉蘭，王曉玉，張麗媛，等.反相高效液相色譜法同時測定四妙丸中鹽酸小聚堿與蒼術素的含量[J].中南藥學，2010，8（4）：259-262.

[7] 南洋，賈凌云，李倩，等.RP-HPLC法同時測定蒼術中蒼術素和白術內酯Ⅱ的含量[J].藥物分析雜志，2010，30（1）：17-20.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].（第1部）北京：中國醫藥科技出版社，2010：150-151.