分泌型卷曲相關蛋白1與慢性牙周炎的相關分析

袁海波　金晶　許春姣等

[摘要] 目的 檢測分泌型卷曲相關蛋白1（SFRP1）在慢性牙周炎（CP）患者和牙周健康者的表達情況，探討SFRP1在CP的發生與發展過程中的作用。方法 選擇CP患者28例為試驗組，按臨床附著喪失（CAL）程度分為輕、中、重度3組，另外選擇牙周健康者10例為對照組。收集兩組研究對象的齦溝液，采用酶聯免疫吸附法測定齦溝液中SFRP1的質量濃度。取試驗組中22例CP患者的病變牙齦組織標本，以及10例對照組的正常牙齦組織，進行SFRP1免疫組織化學染色，觀察著色強度，分析SFRP1表達與不同程度CP的相關性。結果 1）試驗組和對照組齦溝液中SFRP1的質量濃度分別為（281.07±33.37）和（245.30±35.69）ng·L-1，試驗組明顯高于對照組（P<0.05）；齦溝液內SFRP1質量濃度與CAL呈明顯正相關（r=0.651，P<0.001）。2）試驗組SFRP1著色強度積分值（4.500±0.913）明顯高于對照組（2.800±1.135）（P<0.001）；試驗組中，輕、中、重度CP組間的著色強度積分值無明顯差異（P>0.05）。結論 SFRP1在CP患者齦溝液及牙齦組織中的表達高于牙周健康者，SFRP1可能參與了CP的發生發展過程。

[關鍵詞] 慢性牙周炎； 齦溝液； 分泌型卷曲相關蛋白1

[中圖分類號] R 783.5 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.017

分泌型卷曲相關蛋白1（secreted frizzled-related protein 1，SFRP1）是一種分泌型糖蛋白，是Wnt信號通路的重要拮抗劑。Wnt信號通路能影響人牙周膜成纖維細胞（periodontal ligament cells，PDLCs）的成骨分化調節骨生成和改建[1-2]，由此推測，SFRP1與慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）可能存在密切關系。本研究通過檢測CP患者齦溝液中SFRP1的水平及病變牙齦組織中SFRP1的表達，探討SFRP1在CP發生中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料與研究對象

SFRP1酶聯免疫分析試劑盒（R&D;公司，美國），SFRP1兔抗人、鼠多克隆抗體（Abcam公司，美國），通用型Streptavidin-HRP試劑盒、免疫組織化學DAB顯色劑（北京康為世紀生物科技有限公司）。

實驗對象均取自2011年3—12月在中南大學湘雅醫院口腔科就診的患者，選擇CP患者28例為試驗組，牙周健康者10例為對照組。CP患者按照臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL）分為3度：輕度CP患者9例，CAL為1～2 mm；中度CP患者10例，CAL為3～4 mm；重度CP患者9例，CAL≥5 mm。試驗組與對照組年齡、性別均匹配。所有研究對象均了解本次研究目的，同意參與并配合試驗，全身健康狀況良好，并符合以下要求：1）無糖尿病、心血管疾病、類風濕疾病等全身系統性疾病，無其他系統感染；2）近半年內未接受過牙周治療，近3個月內未服用過抗生素、免疫抑制劑等藥物；3）女性未處于妊娠期、哺乳期、月經期；4）咬合關系正常，無正畸治療史；5）無長期吸煙和酗酒史。

1.2 試驗方法

1.2.1 SFRP1在齦溝液中的質量濃度 用專用標準濾紙條采集研究對象的齦溝液。采集部位為右下頜第一磨牙的齦溝或牙周袋內6個位點（頰側遠中、頰側中央、頰側近中，舌側遠中、舌側中央、舌側近中）。檢測所有研究對象的牙周臨床指標，包括牙周探診深度（probing depth，PD）、CAL、齦溝出血指數（bleeding index，BI）。采用酶聯免疫吸附法測定齦溝液中SFRP1的質量濃度。

1.2.2 SFRP1在牙周組織中的表達 手術中取22例CP患者的病變牙齦組織（輕、中、重度CP組分別為7、7、8例），10例對照組取手術切取的正常牙齦組織，固定包埋，切片，按照標準二步法進行SFRP1免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察并照相。SFRP1在牙齦組織中的表達使用著色強度積分進行評價[3]，以有棕黃色顆粒狀沉淀為陽性細胞，著色范圍以陽性細胞記分。陽性細胞所占比例≤1%記為0分，2%～

20%為1分，21%～50%為2分，≥50%為3分；著色程度依據深淺記分，無著色為0分，淺著色為1分，深著色為2分。上述兩項分值相加為著色強度積分值：≤1.9分為陰性（-），2～2.9分為弱陽性（+），3～3.9分為陽性（++），≥4分為強陽性（+++）。

1.3 統計學分析

使用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。采用方差分析和LSD法分析各組齦溝液內SFRP1的質量濃度；Spearman相關分析法分析齦溝液內SFRP1質量濃度與CAL的關系；采用獨立樣本t檢驗、方差分析、Tukey分析法分析各組牙齦組織中SFRP1的表達。

2 結果

2.1 SFRP1在齦溝液中的質量濃度

2.1.1 CP組與對照組齦溝液中SFRP1質量濃度比較 經獨立樣本t檢驗，CP組齦溝液的量及SFRP1質量濃度明顯高于對照組（P<0.05）（表1）。

2.1.2 各組齦溝液中SFRP1質量濃度多重比較 輕、中、重度CP組的SFRP1質量濃度分別為（250.42±19.48）、（285.70±21.29）、（306.57±32.50）ng·L-1。輕度CP組與對照組、中度CP組與重度CP組之間齦溝液中SFRP1的質量濃度無明顯差異（P>0.05）；其余各組間兩兩比較均有統計學意義，輕度CP組明顯低于中度和重度組，同時，中度和重度CP組明顯高于對照組，其差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.1.3 SFRP1質量濃度與CAL的關系 經Spearman相關分析，齦溝液內SFRP1質量濃度與CAL呈正相關關系（圖1，r=0.651，P<0.001）。

2.2 SFRP1在牙齦組織中的表達

2.2.1 SFRP1在各組中的表達形態學特點 在正常的牙齦組織中，SFRP1的表達集中在上皮細胞，且棕黃色顆粒多沉積在細胞質中（圖2A）；上皮下結締組織中少有染色，偶見成纖維細胞有陽性表達（圖

2B）。在慢性牙周炎牙齦中，SFRP1的表達較多，染色也較深，其上皮層的表達相對于對照組表達范圍更為廣泛，程度更深；上皮下結締組織中的表達對比明顯，SFRP1高表達于成纖維細胞、單核細胞、內皮細胞等（圖2C、D、E）。

2.2.2 SFRP1在牙齦組織中表達情況的分析 CP組和對照組的SFRP1表達強度見表2。在22例CP病例的牙齦組織中，SFRP1的表達陽性率為100%（22/22），強陽性表達率為77.27%（17/22）；10例對照組中，SFRP1的表達陽性率為80.00%（8/10），強陽性表達率為30.00%（3/10）；CP組和對照組的著色強度積分值分別為4.500±0.913和2.800±1.135，二者差異有統計學意義（P<0.001）。

由表3可見：經單因素方差分析，各組間整體比較其差異有統計學意義（F=7.859，P=0.01），進一步采用Tukey法進行組間兩兩比較，發現除對照組與中度、重度CP之間的差異有統計學意義外（P<0.05），其余組間的差異無統計學意義。

3 討論

在慢性牙周炎的發病過程中，宿主對牙周致病微生物感染的初步應答是激活免疫系統并引發局部炎癥反應，其后釋放一系列細胞因子和其他調節因子，炎癥反應擴散，從而波及到鄰近的結締組織和牙槽骨，導致牙周組織破壞。研究[4-5]表明，在疾病發展過程中，基質金屬蛋白酶（matrix metallopro-teinases，MMPs）、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等蛋白酶和炎癥介質發揮著調節作用。Ma等[6]的研究顯示，在人軟骨細胞中，IL-1β通過一個負反饋回路影響Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）介導的MMPs的表達。Heo等[2]發現，經典Wnt/β-catenin通路能影響人PDLCs的成骨分化，Wnt促進劑氯化鋰能夠促進人PDLCs的增殖分化。這些研究提示Wnt信號通路可能參與了牙周炎的發展過程。

SFRP1是分泌型卷曲相關蛋白家族中的一員，為Wnt信號通路的重要拮抗劑。本研究發現，SFRP1在慢性牙周炎的齦溝液中的質量濃度以及在牙周組織中的表達均高于正常對照組，且有隨慢性牙周炎的嚴重程度增加而增加的趨勢，提示SFRP1與慢性牙周炎的發生進展相關。

3.1 SFRP1在齦溝液中的質量濃度

齦溝液是宿主內外環境交匯的一個微環境，其成分發生變化能客觀地提示宿主的牙周狀態。Hanio-ka等[7]發現，牙周炎患者齦溝液中PGE2、TNF-α、IL-l、IL-8等炎癥因子的濃度高于健康者，從而認為這些炎癥因子可以作為牙周炎的監控指標。目前，對于SFRP1在牙周炎中的研究還較少。本試驗發現，SFRP1在CP患者齦溝液中的質量濃度明顯高于正常對照組，提示SFRP1在炎癥狀態的牙周組織的質量濃度較高。進一步比較輕、中、重度CP及正常對照組，說明SFRP1的質量濃度在正常牙周狀態或輕度CP進展到中度或重度CP過程中發生了變化。本試驗Spearman相關分析表明，齦溝液內SFRP1質量濃度與CAL呈正相關，進一步提示SFRP1的質量濃度與慢性牙周炎牙槽骨破壞的嚴重程度密切相關。

3.2 SFRP1在牙齦組織中的表達

在牙周炎發展的過程中涉及到骨代謝的改變，而Wnt信號通路對骨代謝有著重要的影響。Wnt信號通路的激活能促進成骨，在骨中高表達Wnt信號通路受體低密度脂蛋白受體相關蛋白-5（low-density lipoprotein receptor-related protein-5，LRP-5）功能突變體轉基因小鼠，或缺乏Wnt拮抗劑SFRP1分泌的小鼠，表現出骨礦化密度升高和抑制成骨細胞凋亡[1]；而LRP-5突變可導致骨礦化密度降低及骨折。Bodine等[8]證實，通過敲除小鼠Wnt信號拮抗劑SFRP1，能延長和增強小鼠骨小梁的生長，SFRP1的缺失能夠降低成骨細胞和骨細胞的凋亡，同時增強這些細胞的增殖和分化。

DKK1作為Wnt信號通路的抑制劑，在抑制骨質形成的同時促進骨質破壞，在骨代謝中發揮著重要的作用[9]。Heo等[2]研究了氯化鋰和DKK1對PDLCs的作用，發現Wnt促進劑氯化鋰能夠促進PDLCs的增殖分化，而其拮抗劑DKK1的作用則相反。Li等[10]在研究牙齦卟啉單胞菌誘導形成的牙周炎小鼠模型中發現，炎癥細胞、成纖維細胞及骨細胞中SFRP1的表達明顯高于對照組；在實驗組加入SFRP1抗體，另一組加入IgG抗體作為對照，可以發現實驗組上皮萎縮和附著喪失顯著低于對照組，破骨細胞、中性粒細胞、單核白細胞計數也低于對照組。由此可見，抑制SFRP1的表達能夠降低牙周組織的破壞，減少炎癥浸潤，降低破骨細胞數量。

本研究發現，SFRP1在牙周炎及正常牙齦組織中均有表達，但在慢性牙周炎中的表達程度更高；從正常牙周狀態進展到中度或重度慢性牙周炎過程中，牙齦組織中的SFRP1質量濃度發生了變化，提示SFRP1參與了牙周炎的發展過程。

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（本文編輯 吳愛華）