羅源灣養殖大黃魚虹彩病毒的PCR檢測

楊小強 福州市海洋與漁業技術中心 福州 350026

大黃魚是福建省最大的海水養殖魚類，2011年產量達到8.6萬t、產值60多億元，年出口創匯近億美元。我們常年對福建羅源灣網箱養殖大黃魚開展病害監測工作，2009年開始發現高溫期一種養殖戶均稱之為“白鰓病”的危害日趨嚴重，據不完全統計2011年羅源灣養殖大黃魚因患“白鰓病”的病死率約30%。大黃魚“白鰓病”主要流行于高溫季節，主要癥狀表現為：患魚水面游動緩慢，或漂浮于水面；體表完好，體色偏白，鰓絲呈貧血狀態，發白；解剖發現脾、腎腫大；5～10 cm的幼魚到成魚均可發病。經流行病學檢測未發現寄生蟲、細菌和水質惡化、營養不良等致病因素，抗菌藥物治療無明顯效果，存在病毒感染的可能。大黃魚“白鰓病”發病癥狀與何愛華[1]、陳新華[2-3]等報道的大黃魚虹彩病毒(LYCIV)病癥狀相似，因此，本研究根據虹彩病毒特異性引物，應用PCR法對患魚進行檢測[4]，旨在初步診斷大黃魚“白鰓病”的病原，為該病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品處理 2012年7～10月，從羅源灣收集網箱“白鰓病”癥狀明顯的大黃魚幼苗與養成魚，經檢測排除寄生蟲、細菌感染。采集樣品鰓絲、脾臟、腎臟、肝臟、性腺（成魚），95%乙醇，-20℃保存，或置于離心管中，-86℃保存，備用。

1.2 試劑 北京百泰克公司細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型，用于快速提取各種動物細胞/組 織 基 因 組 DNA），2×Power PCR MasterMix，250 bp GeneRu1er DNA Ladder Mix。

1.3 核酸的提取 脾臟、腎臟、肝臟等組織，按北京百泰克公司細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）使用說明書提取。

1.4 PCR擴增及測序 按照Manua1 of Diagnostic Tests for Aquatic Anima1s-RED SEA BREAM IRIDOVIRAL DISEASE[4]建立的PCR檢測方法進行RSIV的檢測，基于虹彩病毒ATPase序列和DNA聚合酶系列分別合成兩對引物1F/1R、2F/2R：

1F:5′-CTC AAA CAC TCT GGC TCA TC-3′；1R:5′-GCA CCA ACA CAT CTC CTA TC-3′；

2F:5′-CGG GGG CAA TGA CGA CTA CA-3′；2R:5′-CCG CCT GTGCCT TTT CTGGA-3′。

其中1F/1R能同時擴增RSIV/ISKNV病毒基因，目的產物570 bp；2F/2R特異擴增RSIV病毒基因目的產物568 bp。50 uL PCR反應體系：2×Power PCR MasterMix 25 uL，10 uM引物2 uL，模板DNA 4 uL ，ddH2O 17 uL。

PCR 程序 1：94℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 60 s，30個循環；

PCR 程序 2：94℃ 30 s，54℃ 60 s，72℃ 60 s，30個循環。

PCR擴增結束后，經2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物，檢測到的陽性樣品PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5序列比對與分析 用引物1F/1R，2F/2R進行擴增產物序列測序，利用MEGE4.0軟件將得到的序列與GENEBANK中的RSIV各株系進行同源性分析并構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 樣本的PCR檢測 取50 mg各組織樣品經勻漿后，用北京百泰克公司細胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。由引物1F/1R、2F/2R對樣品進行PCR擴增分別獲得571 bp及 536 bp兩條目的條帶(圖1)，表明擴增產物為虹彩病毒特異片段。兩條序列分別標記為1y1和1y2。從圖2、圖3中患魚各組織PCR擴增情況可以看出，患魚各器官組織中病毒數量不一樣。圖4中用引物1F/1R、2F/2R分別擴增同一陽性樣品腎臟組織中的病毒發現目的條帶的亮度存在明顯差異，說明這兩對引物對目的片段的擴增效率可能不一樣。

圖1 虹彩病毒PCR擴增

圖2 引物1F/1R擴增不同組織中的RSIV/ISKNV病毒

圖3 引物2F/2R擴增不同組織中的RSIV病毒

圖4 引物1F/1R、2F/2R擴增同一陽性樣品腎臟組織中的病毒

2.2 測序與構建系統發育樹 將獲得的兩條特異系列1y1、1y2序列結果與GENEBANK中相似度最高的虹彩病毒毒株序列進行比對，并應用MEGE4.0軟件對序列進行分析，結果如圖5所示1y1序列與大黃魚虹彩病毒（LYCIV）聚在一起。圖6所示1y2序列與真鯛虹彩病毒（RSIV）聚在一起。

1y1 序列(571 bp)：

ACCCAACCCCATCTCCTATCTCAAGCACAGTGAAC ATCTTTTACTTGTATAAAAATTTTGAATATCCTCAT GTCATAGGTGACTACTGTGAATCATAGCTACATGA GCAATGGCGACCCTGCTACTTCTTCTGTTGCTGACT GTGGCGTGTACTCACGCCACCACCTTCTATAACCT GGAAATCGACAACCAGACGACCACCCTCAGCTGC GGGGTACCTCGAGAGACGGATGTGAAGATTGTTT GGTCAAGCGACAGCAACAGCCTCTTGGCGGAGCA TGTTGTACATGGCGAGGTGGTCCATGTAGGCCGCA ACAGCAGTGAAGTCCTGAAGCATGGAGTGGTGCT GTATGACGGTACCATCTTGTCTGTCATCAAGCTGA AACCTCACCCTGTGCAGACCGTCACATGCCACGCC AGCCGCATCTCATCTGACAGTCAGCCTTGTGTAGG TGTCTCATGTGAGCTGCCAACAGACACCGATAATG TTACTCCACCGCCTACACTGCTTGACGATGGGGGC AGCGGAATGGACGACTACGATGACATAGATGAGC CAGGTTGTTTGAGA

圖5 基于虹彩病毒ATPase序列構建的系統發育樹

1y2 序列(536 bp)：

TTGGAGCGATGGTTGTTGTCGTCCCATTGCCGATA TCCTGCACACTCTTTGTCAGCACAAAGTCGTCATC TTGAAGCGCTCCCGGTATCATCATGTCGTGCATCA TGCGCACAGCAATGAATGGCACATCTGCAGACCC CTCAAGGATTGCACTCATGATTGCTGCATACGTGT TTCTGGCACACATGGCGCTGTCACGTCTGGACAAC ATGACACCCTTGCTGCCTGTTCGCTGCTTGCCGTCG CGTGTGAATGCCCTGTACACATAACGTTTCTTGGT GAAGATGATGAACTTGGTGTAGATGCACTGCTCAA ACTCGAGGCGCACCGGGCGCTCAAAGAAGGCCGA CACAGTGTCACTGGCGTTTACAGCCATCTGCCACA GTTCATCGAGTGATGCGCGGTCGTGGCCCAGCTGT ATGTAGCATGAGTCGGTGTCGCCGTACACAATGGT AGCGCCCACCACCGTCTTGAGGAGATGAGCGGCTT TCTCAATCAGCTTGCGGCCGCAGTATGTAGTCGTA TTTGGCCCCCGA

圖6 基于虹彩病毒DNA聚合酶序列系統發育樹

2.3 臨床病料的收集與檢測結果 根據臨床癥狀，排除細菌和寄生蟲感染，共采集到疑似患虹彩病毒性疾病的病料80尾。檢測結果見表1。

表1 采樣與檢測結果

3 討論

虹彩病毒是一類對魚類、兩棲類和爬行類水生動物具有廣泛感染性的病原，由虹彩病毒感染所致的水產動物疾病已成為世界水產養殖業的嚴重問題[5]。在我國，多種魚類虹彩病毒陸續被發現，其宿主幾乎涵蓋我國主要的海水養殖魚類以及重要的淡水養殖魚類，目前已報道的國內感染魚類的虹彩病毒有真鯛虹彩病毒（RSIV）、傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）、臺灣石斑魚虹彩病毒(TGIV)、大菱鲆紅體病虹彩病毒(TRBIV)、大黃魚虹彩病毒(LYCIV)等。在大黃魚感染虹彩病毒的研究方面，1999年何愛華等[1]在福建省沿海人工養殖大黃魚幼魚脾臟中觀察到疑似虹彩病毒顆粒，2003年陳新華等[2-3]報道了1999年至2001年夏季暴發流行于福建省寧德、羅源等地養殖大黃魚幼魚感染虹彩病毒并建立了PCR快速檢測技術，并將其命名為大黃魚虹彩病毒（Large ye11ow croaker iridovirus,LYCIV）。

虹彩病毒檢測與鑒定的手段主要有組織病理學、形態學、免疫雜交、普通PCR、多重PCR、環介導等溫擴增技術、熒光PCR、電鏡等[6]。由于RSIV/ISKNV沒有適合的細胞培養系，無法進行病毒增殖培養與分離，所以，PCR方法仍是OIE推薦的主要檢測方法[7]。PCR方法具有靈敏度高、特異性操作簡便、成本低廉和普遍適用等優點，所以，該方法已成為我國水生動物病毒檢測的主要方法，非常適合用于未出現臨床癥狀期間的早期檢測，可用于疫病的防控。

本研究利用PCR法獲得的兩條病毒DNA基因片段1y1、1y2與分別與已報道的大黃魚虹彩病毒（AY779031）和真鯛虹彩病毒（AB104413）高度相似。根據流行病學調查，羅源灣養殖大黃魚“白鰓病”的發病水溫 22～30℃，與何愛華[1]、陳新華[2-3]等報道的發病水溫相似。由此判斷，高溫期羅源灣大黃魚大面積發生的“白鰓病”養殖大黃魚感染了虹彩病毒。

病毒類型還有待進一步的研究，存在1種或多種虹彩病毒混合感染的可能。采用OIE手冊推薦的方法擴增產物為RSIV或ISKNV的特異片段，病樣中擴增到的病毒DNA基因片段1y1系列與大黃魚虹彩病毒（LYCIV）特異片段高度相似，由此判斷病樣中病毒類型為大黃魚虹彩病毒（LYCIV）、真鯛虹彩病毒（RSIV）和傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）中的1種或多種。圖4中用引物1F/1R、2F/2R在同樣的反應體系情況下分別擴增同一陽性樣品腎臟組織中的病毒發現目的條帶的亮度也存在明顯的差異，也說明這個病樣中可能存在不至一種病毒。

根據國際病毒分類委員會(ICTV)第8次報告真鯛虹彩病毒（RSIV）屬虹彩病毒科細胞腫大病毒屬[8]。細胞腫大病毒屬病毒引起的疾病是一種全身性的感染，出現大量腫大細胞是細胞腫大病毒重要的感染特征之一。腫大細胞在魚體的各個器官組織幾乎均有分布，其中脾臟和腎臟中數量較多而在肝臟、鰓及腦中數量較少[7]。全身性失血和脾、腎腫大是大黃魚“白鰓病”的典型癥狀。在病料的鰓絲、肝臟、脾臟、腎臟及性腺等組織器官中能檢測到的組織為肝臟、脾臟和腎臟。觀察檢出的陽性病料的肝臟、脾臟和腎臟的PCR結果發現，雖然每種組織量一樣，除去PCR效率因素，PCR目的片段條帶亮度還是有所不同，說明病魚各組織中病毒量可能有差異，其中腎臟組織中病毒含量最高（如圖2-圖3）。

何愛華[1]觀察到的發病魚體長5～10 cm。陳新華等[2]2001-2003年間對福建寧德、漳蒲及廈門等地魚排進行了跟蹤檢測，發現該病毒在上述地區養殖場呈現不同規模的流行，發病魚多為8～15 cm的幼魚。本研究發現體長5～30 cm及以上的患魚能檢測到虹彩病毒基因特異目的片段（表1），說明該病毒在大黃魚養殖生產上的危害的嚴峻性，有必要進一步跟蹤檢測研究。

[1] 何愛華,林奕堅,郭永健,等.大黃魚幼魚虹彩病毒感染的電鏡研究[J].福建水產,1999(3):56-59.

[2] Chen X H,Lin K B,Wang X W.Outbreaks of an iridovirus disease in maricu1tured 1arge ye11ow croaker,Larimichthys crocea(Richardson)in China[J].Journa1of Fish Diseases,2003,26:615-619.

[3] 陳新華,董燕紅.大黃魚虹彩病毒PCR快速檢測試劑盒的研制[J].生物技術,2005(3):38-40.

[4] OIE.Red Sea Bream Iridovira1 Disease Manua1 of Diagnostic Tests for Aquatic Anima1s[M].Paris:Office Internationa1des Epizooties,2009:251-261.

[5] 趙玉然,岳志芹,譚樂義,等.山東沿海部份地區真鯛虹彩病毒病初步調查與分析 [J].漁業科學進展,2011,32(6):31-36.

[6] 蕭楓,張奇亞.水生動物虹彩病毒的分子生物學[J].水生生物學報,2004,28(2):202-206.

[7] 李華,孫志鵬,李強,等.條石鯛檢出的虹彩病毒特性研究[J].病毒學報,2011,27(2):158-164.

[8]洪健,周雪平.ICTV第八次報告的最新病毒分類系統[J].中國病毒學,2006,21(1):84-96.