2個新育成黃芪品種（系）的RAPD研究

劉效瑞，楊 寧，王春明，尚虎山，汪淑霞，王興政

（1.甘肅省定西市旱作農業科研推廣中心，甘肅 定西 743000；2.西北師范大學，甘肅 蘭州730070）

我國中藥材資源豐富，是世界藥材的主產國，對中藥材的研究有幾千年的歷史。甘肅省自然條件雖然惡劣，但卻是中藥材生長的適宜地帶，中藥材生產在全國具有明顯的競爭優勢，為全國中藥材優勢產區和生產大省，其中黃芪栽培面積和產量約占全國的50%左右。黃芪（Radix Astragali）又名黃耆，為植物和中藥材的統稱。植物黃芪產于內蒙古、山西、甘肅、黑龍江等地，為國家三級保護植物。黃芪是臨床常用中藥材，其化學成分眾多，主要含有皂苷類、黃酮類、多糖類等有效成分。黃芪來源于豆科植物膜莢黃芪［Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge］和蒙古黃芪［Astragalus membranaceus （Fisch）Bge.Var.mongholicus（Bge.）Hsiao］的干燥根，為我國傳統的補氣藥［1～3］。黃芪的藥用迄今已有2 000多年的歷史，大量的臨床研究證實，黃芪具有保護心臟及腎臟、雙向調節血糖及血壓、抗缺氧、抗自由基氧化、抗衰老、抗腫瘤及增強機體免疫力等功效［2～3］。目前甘肅黃芪栽培中普遍使用的品種為黃芪屬多種類型的混和體，田間表現良莠混雜，難于管理，且品種（系）親緣關系不明確，缺乏品種（系）鑒定的分子依據，嚴重制約著當地黃芪的產量和品質。另外，藥材的道地性一直是評價藥材品質的綜合性標準，產生道地性的原因，除了栽培方法、生態環境、加工方法外，還與物種居群的遺傳特異性有關。道地藥材與非道地藥材在形態和生藥性狀等特征上的差別并不明顯，這給應用傳統方法鑒別道地藥材帶來了困難。

隨機擴增DNA多態性（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）技術以其操作簡單、快速、花費少、DNA用量少、無放射性等優點，廣泛應用于中草藥種質資源親緣關系、遺傳多樣性及藥材道地性研究等方面［4～5］。我們針對甘肅省黃芪生產及銷售實際中不能提供科學的藥材道地性鑒定等問題，利用RAPD技術對甘肅省定西市旱作農業科研推廣中心新選育的2個黃芪品種（系）進行分析鑒定，以考證其遺傳多樣性和親緣關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試黃芪樣品為隴芪1號（編號為HQ1）、HQN03-03（編號為HQ2），均由甘肅省定西市旱作農業科研推廣中心提供。于2011年7月20日分別采集2個黃芪品種（系）的幼葉各50片，用硅膠干燥后帶回實驗室。RAPD引物由北京奧科生物技術公司生產，所用Taq酶及dNTPs購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取 采用SDS法提取植物基因組DNA［6～7］。稱取0.3 g干葉片，加液氮研磨至粉末狀移入離心管，加入4mL已預熱到65℃的提取液充分混勻，65℃水浴30min，每3min混勻1次。向離心管中加入等體積的氯仿異戊醇（24∶1）抽提1 h，8 000 r/min離心15min，取出上清液，再抽提2次，而后加入2倍體積的-20℃的無水乙醇，混勻后放在-20℃下靜置30min，吸出無水乙醇后加入70%乙醇，并輕柔混勻30 s，重復4～5次，以去除雜質。將DNA挑出后放入已加入300 uL TE液的離心管中，待DNA完全溶解后分裝，4℃下保存待用。對提取的2個供試黃芪品種（系）的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，為后期PCR擴增提供良好的模板。

1.2.2 PCR擴增 擴增反應在BIO-RAD普通型PCR儀上進行。采用RAPD分子標記技術，分析鑒別新選育出的2個黃芪品種（系）的遺傳多樣性和親緣關系。采用SDS方法提取植物基因組DNA，利用RAPD—PCR擴增反應體系（①RAPD反應體系模板DNA 1.2 uL，隨機引物2.0 uL，dNTPs 1.3 uL，Buffer 2.5 uL，Taq酶 0.5 uL，加ddH2O至25.0 uL；②擴增程序為94℃預變性5min后，94℃1 min，35℃ 1 min，72℃ 2 min，共計40個循環，最后72℃延伸10 min。） 進行PCR擴增反應。然后采用1.4%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（EB）染色，UVI凝膠圖像分析系統觀察照相。每個實驗重復3次。

1.2.3 數據處理 參照Williams等的方法［8］，電泳擴增圖譜中的每一條帶（DNA片段）均為一個分子標記（Marker），并代表一個引物結合位點，根據各分子標記在相同電泳遷移率下（相同分子量片段）的有無，統計得到所有位點的二元數據，有DNA擴增帶（顯性）為1，無帶（隱性）記為0，強帶和弱帶賦值為1。對于多態性位點，采用在重復試驗中能穩定出現的差異帶用于數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同引物對2個黃芪品種（系）的擴增結果

從表1可以看出，通過引物篩選，分別從HQ1和HQ2中挑選出譜帶清晰、重復性好、多態性較豐富的12條和13條隨機引物，用于PCR擴增反應。從HQ1挑選出的12條引物為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P10、 P12、P13、P14、P15 ，從 HQ2挑選出的13條引物為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P13、P15。從HQ1篩選出的12條引物共擴增出112個位點，不同引物的擴增位點變幅為7～13個，平均每條引物能擴增出9.3個位點；從HQ2篩選出的13條引物共擴增出107個位點，不同引物的擴增位點變幅為6～12個，平均每條引物能擴增出8.2個位點。

表1 2個新選育黃芪品種（系）的引物序列和擴增結果

2.2 相同引物對2個黃芪品種（系）的擴增結果

利用HQ1和HQ2可共用的12條引物，分別擴增2個黃芪品種（系），從而在分子水平上反映2個黃芪品種（系）間的遺傳差異性。篩選出的12條引物分別為P1、P2、P3、P4、P5、P6、 P7、P9、P10、P13、P14、P15（引物及其擴增條帶數見表1）。結果顯示，HQ1和HQ2的主譜帶基本一致，說明它們的遺傳背景具有很大的相似性，但是兩者間的次譜帶存在明顯差異。相同引物擴增2個黃芪品種（系）產生的總位點數的范圍為13～25個；其中多態性位點的差異變幅為1～3個。這說明2個黃芪品種（系）間存在遺傳學差異，具有遺傳多態性位點（圖1）。

圖1 HQ1和HQ2的RAPD電泳圖譜

3 小結與討論

本研究對模板DNA含量和dNTPs含量兩個因素進行了優化分析，建立了適合黃芪材料的RAPD—PCR擴增反應體系，并對引物退火溫度和電泳中瓊脂糖濃度進行了篩選，最終確定了黃芪的最適RAPD—PCR擴增反應體系為：模板DNA 1.2 uL，隨機引物2.0 uL，dNTPs1.3 uL，Buffer 2.5 uL，Taq酶0.5 uL，ddH2O 17.5 uL；RAPD引物最佳退火溫度為35℃，最適瓊脂糖濃度為1.4%。此體系的建立可以為其它黃芪品種（系）的RAPD擴增提供參照依據。

RAPD是一種顯性標記，能從分子水平上揭示材料間存在的遺傳差異［9～11］。從RAPD的結果可以看出，隴芪1號篩選出的12條引物共擴增出112個位點，平均每條引物能擴增出9.3個位點；HQN03-03篩選出的13條引物共擴增出107個位點，平均每條引物能擴增出8.2個位點。供試的2個黃芪品種（系）的主譜帶基本一致，說明它們的遺傳背景具有很大的相似性，2個黃芪品種（系）間遺傳關系較近。這種情況可能是由于供試的2個黃芪品種（系）在種植過程中地理分布近，且黃芪是自花不孕或自交不親和的異花授粉植物［12］，從而使二者間相互授粉的幾率大大提高，造成遺傳關系較近。但次譜帶存在不同程度的差異，從分子水平上說明這2個黃芪品種（系）具有一定的遺傳差異性，也體現了甘肅省黃芪品種（系）資源具有較豐富的遺傳多樣性。

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