植物病原菌拮抗性野生艾蒿內生菌的分離、篩選和鑒定

徐亞軍，趙龍飛，*，陳 普，蔣曉瑞，韋革宏

(1.商丘師范學院生命科學學院，河南省高校植物與微生物互作重點實驗室，河南省高校生物質降解與氣化工程技術研究中心，商丘 476000;2.西北農林科技大學生命科學學院，旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，楊凌 712100)

野生艾蒿(Artemisia argyi Levl.et Vant)是一種菊科(Asteraceae)多年生半灌木狀草本藥用植物，在我國的東北、華北、華東、華南、西南以及陜西及甘肅等地區都有廣泛的分布。在干旱、半干旱的高溫條件下，由于艾蒿類植物有很強的適應性，尤其具有耐風蝕、耐高溫、抗嚴寒，加之具有較高的生物量、根系粗壯、木質化、水平根系發達等特點，是一種優良的水土保持植物，對生態環境的保護和恢復起到非常重要的作用。

艾蒿中主要化學成分為揮發油類、黃酮類、桉葉烷類和三萜類等化合物，對其活性研究表明，艾蒿中的黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、抗癌和抑菌等多種生物活性［1］。對野生艾蒿資源開發已有許多研究，孫天竹［2］對野生艾蒿的色素提取方法、穩定性測試及提高色素穩定性進行了研究;顧小衛［3］研究了野生艾蒿中如何提取揮發油，張玲春［4］等測定了艾蒿粗提物對甜菜夜蛾的胃毒作用，以及與其它藥劑及幾種增效劑的聯合作用;艾蒿莖、葉的水浸提液對冰草和披堿草幼苗芽長和根長具有顯著的化感作用［5］。利用水浸提法制得的艾蒿提取液對大腸桿菌［6］、金黃色葡萄球菌［7］進行試驗，結果表明對兩種病原細菌都有很好的抑制活性。

植物內生菌(Endophyte)是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于植物的各種組織和器官的細胞間隙或細胞內的微生物，是一種重要的微生物資源，也是新型天然活性物質的重要來源之一。目前，已報道在各種農作物及經濟作物中發現的植物內生細菌有革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性桿菌，分屬于54個屬的129種，除根瘤菌外，大多為土壤微生物種類，其中假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)以及土壤桿菌屬(Agrobacterium)、泛菌屬(Pantoea)、固氮菌屬(Diazotrophicus)等最為常見，這些內生菌幾乎存在植物的所有組織中。植物內生菌侵入寄主植物后，不易受環境條件的影響，具有穩定的生存空間，可在其中定殖和運轉。其中，一些植物內生菌是很好的生防資源，它們的防病機理主要表現在通過產生抗生素類、水解酶類、植物生長調節劑和生物堿類物質，與病原菌競爭營養物質或空間，增強宿主植物的抵抗力以及誘導植物產生系統抗性等途徑抑制病原菌生長［8］。

在特定的環境和生理條件下，內生菌不僅能脅迫促進寄主植物體內次生代謝產物的形成和累積，而且自身也可產生與宿主相同或不同的生理活性物質［9］。然而，目前國內外對藥用植物艾蒿的研究多集中在生物學特性上［10］，但對該植物內生細菌資源的研究相對較少。由于內生菌和宿主經長期的協同進化形成了互惠互利的關系，二者在代謝和理化方面存在密切的合作。其內生菌的抑菌能力是否因為受到植物特殊營養成分刺激而加強，目前相關報道還很有限，因此系統地研究艾蒿內生菌資源，探索其對當地植物病原真菌的拮抗作用，篩選有抑菌活性的內生菌，為進一步研發生物接菌劑、生物防治劑和維持生態平衡提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

野生艾蒿于2012年5月份采自河南省商丘市梁園區西部郊區荒地。植株處于營養生長期，植株周圍有雜草生長。采樣地地理坐標為:N34°25—36'、E115°37—40'，海拔52m，地勢平坦，排水狀況良好，土壤干燥，系沙壤土，pH7.8。

植物病原菌:棉花枯萎病菌FO101(Fusarium oxysporum)、稻瘟病菌MG102(Magnaporthe grisea)、煙草赤星病菌AA103(Alternaria alternata)由西北農林科技大學生命科學學院微生物學教研室惠贈，以菌核的形式保藏在-70℃冰箱中，傳代培養采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，28℃培養2d。

1.2 方法

1.2.1 野生艾蒿內生菌的分離、純化

組織表面消毒參考文獻［11-12］，內生菌分離和純化采用平板涂布法，平板上長出的單菌落經染色、鏡檢，保藏于試管斜面中備用。

1.2.2 抑菌活性測定

對內生菌抑菌活性的初篩、復篩采用對峙法［13］。抑菌率按照公式計算，抑菌率=［(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑］×100%。初篩出優良菌株進行復篩，過程如初篩，每個處理3個重復。

1.2.3 微生物生理生化特性、菌落特征和細胞形態特征的測定

按照東秀珠［14］方法對所分離的菌株進行生理生化特性、形態特征、革蘭氏染色、芽孢染色和菌體大小等指標的測試。

1.2.4 16S rDNA序列測定及系統發育分析

采用細菌基因組DNA試劑盒OSR-M502(天根生化科技有限公司生產)提取細菌基因組DNA，并以之為模板，進行16S rDNA的擴增。所用引物、擴僧體系、反應條件見參考文獻［13］，擴增產物送上海生物工程技術服務公司測序，根據測序結果，將擴增得到的序列在GenBank中進行BLAST分析，用DNAMAN6.0進行序列相似性分析，通過Clustal-X1.81和TREECONW軟件(version 1.3b)，以Neighbor-joining方法構建系統發育樹，用Bootstrap(1000次重復)進行檢驗。

1.2.5 病原菌菌絲的顯微觀察

把菌落直接放置于倒置顯微鏡的載物臺，觀察處理菌株和對照菌株菌絲體的形態變化，記錄并拍照。

2 結果與分析

2.1 初篩實驗結果分析

從根、莖、葉中分離到的內生菌，分別對棉花枯萎病菌、稻瘟病菌、煙草赤星病菌進行抑菌試驗，初篩結果(表1)表明:對3種植物病原菌具有抑制作用的內生菌的數量分布上差別不大，而野生艾蒿內生菌中對不同病原真菌有抑制作用的數量存在差異。由此可見，對不同植物病菌來說，同一種植物內有抑菌作用的內生菌的抑菌廣譜性方面存在差異。

表1 根莖葉部位對植物病原菌有抑菌作用內生菌的數量及所占比例Table 1 The number and percent of inhibiting endophytes from different parts of plant to pathogenic bacteria

2.2 復篩實驗結果分析

圖1 分離菌株R6對棉花枯萎病菌FO101的抑制作用(左圖為對照)Fig.1 Fusarium oxysporum FO101 inhibited by endophyte R6(Left:control)

圖2 分離菌株S11對煙草赤星病菌AA103的抑制作用(左圖為對照)Fig.2 Alternaria alternata AA103 inhibited by endophyte S11(Left:control)

表2 內生菌對棉花枯萎病菌的抑菌效果Table 2 Inhibition effect of endophytes to Fusarium oxysporum

分別篩選出抑菌現象明顯(抑菌率達20%以上)(圖1、圖2)的菌株進行復篩。每個平板做3個重復，培養72h后分別測定菌落直徑大小，取3個重復的平均值，代入抑菌率計算公式，計算抑菌率的大小(表2、表3和表4)。來自于莖部的內生菌有4株，對棉花枯萎病有明顯的抑制作用，抑菌率均達到17%以上，最大抑菌率為28.24%;葉片分離的內生菌有2株，對棉花枯萎有明顯的抑制作用，最大達26.78%;根部分離的內生菌有1株，對棉花枯萎的抑制作用最為明顯，抑菌率達到32.61%。對比分離自根部、莖部和葉片的內生菌對棉花枯萎病菌的抑菌率發現，在P＜0.05水平上存在明顯的差異。由此可見，不同部位內生菌對棉花枯萎病的抑菌效果表現為:根部＞莖部＞葉片。

表3 內生菌對稻瘟病菌的抑菌效果Table 3 Inhibition effect of endophytes to Magnaporthe grisea

來自于莖部的內生菌有9株，對稻瘟病有明顯的抑制作用，抑菌率均達到20%以上，最大抑菌率為36.30%;葉片分離的內生菌有7株對稻瘟病有明顯的抑制作用，抑菌率達到24%以上，最大抑菌率為39.28%;根部分離的內生菌有4株，對稻瘟病有明顯的抑制作用，抑菌率達到21%以上，最大抑菌率為37.98%。對比分離自根部、莖部和葉片的內生菌對稻瘟病的抑菌率發現，在P＜0.05水平上存在明顯的差異。由此可見，不同部位內生菌對稻瘟病的抑菌效果表現為:葉片＞根部＞莖部。

來自于莖部的內生菌有4株，對煙草赤星有明顯的抑制作用，抑菌率均達到25%以上，最大抑菌率為32.10%;葉片分離的內生菌有2株，對煙草赤星有明顯的抑制作用，抑菌率達到27%以上，最大抑菌率為31.20%;根部分離的內生菌有1株，對煙草赤星有明顯的抑制作用，最大抑菌率為25.04%。對比根部、莖部和葉片的內生菌對稻瘟病的抑菌率發現，在P＜0.05水平上存在明顯的差異。由此可見，不同部位內生菌對煙草赤星的抑菌效果表現為:莖部＞葉片＞根部。

表4 內生菌對煙草赤星的抑菌作用結果Table 4 Inhibition effect of endophytes to Alternaria alternate

對棉花枯萎病抑菌效果最為明顯的是來自根部的菌株R6(其抑制率為32.61%)，對稻瘟病抑菌效果最為明顯的為分離自葉片的菌株L8(其抑制率為39.28%)，對煙草赤星抑菌效果最為明顯的是分離自莖部的菌株S11(其抑制率為32.10%)。可見，分離自野生艾蒿的內生菌對不同植物病原菌的抑菌效果存在差異，稻瘟病＞棉花枯萎病＞煙草赤星。

2.3 菌株的初步鑒定

復篩中對3種病原菌抑制作用較強的菌株R6、L8和S11進行平板培養，經2d培養，平板菌落特征為:菌落均濕潤、不透明、易挑起、生長速度快，菌落正反面顏色一致，菌落邊緣不整齊或呈缺刻狀。其中，菌株R6和L8菌落外觀呈扁平狀，乳白色、表面有光澤;菌株S11外觀平坦，白色、表面無光澤。3株菌的菌落直徑各異(R6:2.5mm、L8:3.0mm、S11:2.0mm)。根據細胞形態特征和生理生化特性試驗結果(表5)，結合東秀珠等編的《常見細菌系統和鑒定手冊》［14］，菌株R6、L8和S11均初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株。

表5 菌株R6、L8、S11的生理生化試驗結果和細胞特征Table 5 Physiological and biochemical test results and cell characteristics of strain R6，L8 and S11

2.4 菌株16S rDNA序列擴增及系統發育學分析

篩選出3株菌的16S rDNA序列經PCR擴增表明，擴增產物長度大約為1.5kb。其在GenBank中的序列登記號為KC245140-KC245142。將菌株的序列與模式菌種序列進行比對，結果表明，菌株L8與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株 NRRL NRS-744T的序列 EU138520相似率最大，達98.7%，該菌株與菌株 Bacillus subtilis NRRL NRS-744T位于同一系統發育分支上，結合其生理生化特性和培養特征，該菌株屬于芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌。菌株S11與模式菌株Bacillus cereus ATCC14579T(AF290547)位于同一發育分支上，二者具有最大的相似率，達99.3%;菌株R6與模式菌株Paenibacillus polymyxa IAM13419T(D16276)同一發育分支上，且二者間相似率最大，達99.1%(圖3)。結合菌株S11和R6的生理生化特征以及培養特征，這兩個菌株分別屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。

表6 測序菌株的分類鑒定結果Table 6 Classification and Identification of the tested strains

圖3 篩選菌株的16S rDNA序列的系統發育樹(系統發育樹分支上的數值表示大于50%的自舉值，括號里是GenBank登陸號，粗體是待測菌株，標尺指核苷酸替代數)Fig.3 Phylogenetic tree generated by the neighbor-joining method based on 16S rDNA sequences of selected strains.Bootstrap values(1000 replicates)are indicated above the branches.Strains obtained are labeled in bold.Bar:0.02 sequence divergence

2.5 病原菌菌絲的被抑制作用

內生菌與病原菌的拮抗培養中，兩菌的菌落從未接觸，而病原菌靠近內生菌的菌落邊緣部分不但有萎縮現象，而且出現黑色壞死部分，鏡檢結果顯示，正常生長的植物病原菌菌絲粗細均勻一致、粗壯、光滑，生長端菌絲舒展(圖4A，D)。棉花枯萎病菌的受作用菌絲(圖4B，C)可以看出:有的菌絲發生波浪形扭曲、畸變(圖4B-g)，有的菌絲打結(圖4C-h)。可能是內生菌R6通過分泌某種活性物質對菌絲發揮作用，一方面溶解病原菌的細胞壁;一方面抑制病原菌的正常生長、代謝以致萎縮、畸變。煙草赤星病原菌的受作用菌絲生長端分枝明顯增多、分枝間隔變短(圖4F)，菌絲扭曲(圖4F-c)，生長邊緣呈珊瑚狀枝(圖4F-d)，并且有的菌絲斷裂，在斷裂處出現了明顯的球狀膨大現象(圖4E-b;圖4F-e);有的菌絲因細胞壁被消解而變得透明(圖4E-a)，還有些菌絲變細、變暗，原生質濃縮(圖4F-f)

3 結論和討論

圖4 艾蒿內生菌R6、S11對植物病原菌發生抑制作用時菌絲的變化(A.棉花枯萎病菌FO101的正常菌絲;B，C.棉花枯萎病菌FO101菌絲的畸形、彎曲打結菌絲;D.煙草赤星病菌AA103的正常菌絲;E F.煙草赤星病菌AA103菌絲的自溶、斷裂萎縮)Fig.4 Mycelia change of plant pathogenic fungi under inhibition of Artemisia argyi endophytes A.Normal mycelia of Fusarium oxysporum FO101;B，C.Deformity，bending knot mycelia of Fusarium oxysporum FO101;D.Normal mycelia of Alternaria alternate AA103;E、F.Autolysis，fracture and atrophy of Alternaria alternate AA103

3.1 通過顯微觀察發現，不同菌株對病原菌的抑制情形各異。稻瘟病菌和煙草赤星病菌受到抑制后有明顯的抑菌區域，但內生菌和病原菌均未接觸，可能是由于內生菌的生長速度快，占據營養空間，對病原菌形成營養上的競爭，使病原真菌因缺乏營養而萎縮、畸變［15］;也可能是在培養的過程中內生菌產生的水解酶類［15］(細胞壁水解酶、幾丁質酶、蛋白酶等)降解了病原真菌細胞壁，或產生了其他致病因子如毒素等，對病原真菌發揮作用的結果［16］。棉花枯萎病受到抑制后菌絲發生扭曲和貼壁現象(圖4B，C)，可能是在培養的過程中內生菌產生了化感物質［15］，如螯合型鐵載體、抗生素、殺菌性揮發物、溶菌酶和解毒酶等。如果產生鐵載體可奪取生長于同一培養基上病原菌生長必需的鐵元素，有效阻礙了病原菌菌絲的正常生長和發育;也許是內生菌產生抗生素類物質［15］如寡霉素A、卡那霉素水解物、雙效菌素A等對病原菌菌絲發生抑制作用、導致菌絲畸形發展，前端變得萎縮、基部多呈珊瑚狀分枝(圖4F);若是產生溶菌酶如胞外幾丁質酶和昆布糖酶對病原菌絲消化、溶解，導致菌絲外壁因部分溶解而發生打折、透明(圖4E-i，a)，抑制病菌的正常生長［17］。易龍等［18］研究支持了這個解釋，煙草內生細菌Itb162對煙草赤星病原菌菌絲生長有明顯的抑制作用，主要是拮抗菌使病原菌菌絲形成膨脹泡，破裂、消解，致使菌絲停止生長。蛋白酶和其他生物控制特性也參與對菌核病以及灰霉病菌生長的抑制作用［19］。類芽孢桿菌也可產生的β-1，3-葡聚糖酶可酶解枯萎病菌的細胞壁，導致菌絲自溶、斷裂［20］;也可能是多種機制的結合。但具體抑制機理仍在進一步研究之中。

3.2 本研究中從艾蒿植株不同部位分離的對病原菌具有較強抑制活性的3株內生菌，結合生理生化特性和培養特征，經16S rRNA基因測序、比對，菌株L8、S11、R6分別屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)和多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。芽孢桿菌屬菌株是最普遍被報道的植物生長促生根際細菌(PGPR)，芽孢桿菌屬的一些種能夠產生次生代謝產物(如多肽類物質)，對植物病原菌(細菌、真菌、線蟲等)具有較強的抑菌活性［17］，可用于生物防治。如多粘類芽孢桿菌在厭氧條件下，大多數菌株能固定氮氣，對人和動植物沒有致病性，是重要的生防微生物，越來越多的拮抗性多粘類芽孢桿菌被分離篩選出來，能夠產生抗菌素、抗菌蛋白、多粘菌素羊毛硫抗生素、多肽類gavaserin和saltavalin等多種生物活性物質［21］，以及產生多種水解酶類(如β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質酶)對病原真菌表現出較好的抑菌活性。已有試驗表明，多粘類芽孢桿菌對小麥全蝕病、由真菌尖孢鐮刀菌引起的植物枯萎病都表現出很好的抑制效果，并且，也能對芝麻出苗前后易出現的立枯病、絲核菌引起的大豆碳腐病也有控制效果。顯微鏡研究表明，對病原菌的控制效應主要表現在對菌絲的腐蝕、溶解，抑制孢子萌發和產生分子量4517Da的抗真菌蛋白［22］。枯草芽孢桿菌也是一種重要的內生細菌，用其來防治真菌病害已有很多報道。如利用枯草芽孢桿菌防治立枯絲核菌、腐霉菌、鐮刀菌等引起的病害，對水稻紋枯病、白葉枯病、條斑病、稻瘟病和惡苗病均有顯著的防治效果［23］。由于芽孢桿菌屬菌株具有芽孢特性，對外界有害因子抵抗力強，把枯草芽孢桿菌和其他芽孢桿菌屬的菌株用于種子包衣來防治植物疾病的發生，用于生物肥料和生物菌劑均具特殊的穩定性。因此，利用野生艾蒿植株的內生芽孢桿菌開發生物防治劑，抑制植物病原菌、維持生態平衡具很大的應用潛力。

3.3 植物內生菌由于長期與植物共生，相互間存在密切的聯系。野生艾蒿浸提物對病原菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌［5］的抑制作用得以證實，但對不同植物病原真菌來說，艾蒿內生菌所產生的抑菌作用廣譜性和抑菌效果方面存在差異，此外，分離自野生艾蒿不同部位的內生菌對不同植物病原菌的抑制效果間也存在差異。這可能與藥用植物艾蒿不同組織部位的內含化學成分［2］(揮發油、黃酮、桉葉烷和三萜類化合物等)的含量有關，植株不同部位的內生菌受其內含成分的影響，內生菌產生的次生代謝產物的量和種類可能存在差異。但具體的機制有待進一步的研究。

致謝:感謝商丘師范學院賴心河博士和張富強博士對寫作給予的幫助。

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