薇甘菊萎蔫病毒感染對薇甘菊光合特性和4種酶活性的影響

王瑞龍，潘婉文，楊嬌瑜，張暉，夏晴晴，蘇貽娟，曾任森，*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，廣州 510642;2.農(nóng)業(yè)部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，廣州 510642;3廣東省普通高等學(xué)校農(nóng)業(yè)生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境重點實驗室，廣州 510642)

研究表明，植物體感染病毒后常出現(xiàn)花葉、矮化、葉片皺縮、頂枯等癥狀，從而使植物的營養(yǎng)生長受到抑制，嚴(yán)重時可引起植物局部或系統(tǒng)壞死［1-4］。寄主植物感染病毒后體內(nèi)會發(fā)生復(fù)雜的生理生化變化，如光合速率下降，葉綠素降解，葉綠體受到破壞，光化學(xué)活性下降等［3-6］。病毒侵染可引起與植物抗病反應(yīng)有關(guān)的一些酶類如超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)和多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)等活性的變化［7-10］。

薇甘菊(Mikania micrantha H.B.K.)是菊科(Compositae)假澤蘭屬(Mikania)多年生草質(zhì)藤本，屬世界性雜草，原產(chǎn)地為中南美洲［11］，是我國危害性極強(qiáng)的外來入侵植物，目前已經(jīng)入侵到廣東、廣西、海南、云南、香港、臺灣、澳門等地［11-13］。因其生長速度快，種子量巨大且極易擴(kuò)散，可以覆蓋其他植物引起森林生態(tài)系統(tǒng)退化，對當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境造成巨大的破壞［12-14］，控制薇甘菊在我國的蔓延已經(jīng)刻不容緩。

作者發(fā)現(xiàn)一種可致使薇甘菊葉片出現(xiàn)萎蔫、葉畸形、皺縮等癥狀的新病毒，將其命名為薇甘菊萎蔫病毒(Mikania micrantha wilt virus，MMWV)，該病毒屬于豇豆花葉病毒科(Comoviridae)蠶豆病毒屬(Fabavirus)龍膽花葉病毒(Gentian mosaic virus，GeMV)的一種新的分離株［15-16］。實驗室內(nèi)和野外試驗表明，MMWV雖不能使薇甘菊致死，但可有效地抑制薇甘菊的生長，MMWV有可能成為生物防治薇甘菊入侵的方法之一［15-16］。

本文從生理生化角度研究了MMWV侵染對薇甘菊光合特性及與植物抗病反應(yīng)相關(guān)的4種主要酶活性的影響，旨在探明MMWV侵染對薇甘菊生理生化指標(biāo)的影響，為利用MMWV生物防治薇甘菊提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

MMWV分離自田間發(fā)病的薇甘菊，利用分子生物學(xué)方法鑒定屬于MMWV［15-16］。

薇甘菊莖段采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗農(nóng)場，剪成長度約9 cm的莖段，扦插在直徑為16 cm的花盆中，每盆1株。待成活后選長勢良好、大小一致的薇甘菊40株。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種處理

在薇甘菊幼苗長到有5—6片葉時，采用常規(guī)汁液摩擦方法接種MMWV，以接種磷酸緩沖液為對照，分別在接種處理后第8、16、24、32天采集接種葉片并測定各項指標(biāo)。

1.2.2 SOD 活性的測定

SOD的測定參照王愛國［17］的方法。稱取薇甘菊葉片0.25 g，液氮研磨后加入2.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液，渦旋10 s，12000 r/min離心15 min，取上清液為酶液，4℃保存?zhèn)溆谩?.05 mol/L磷酸緩沖液1.5 mL，130 mmol/L 甲硫氨酸溶液 0.3 mL，750 μmol/L 氮藍(lán)四唑 0.3 mL，100 μmol/L EDTA-Na20.3 mL，20 μmol/L核黃素0.3 mL，酶液50 μL，蒸餾水0.25 mL加入到比色杯中。混勻后將一管置于黑暗處，其余各管置于4000 lx日光燈下反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后，以黑暗處的為空白對照，分別測定吸光度值，重復(fù)4次。

1.2.3 PAL 活性的測定

PAL的測定用分光光度法［18］。稱取薇甘菊葉片0.1 g，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管中，加入1 mL PAL酶提取液，振蕩1 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液為酶源，4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谠嚬苤懈骷尤?.02 mol/L L-苯丙氨酸1 mL，0.05 mol/L Tris-H2SO4緩沖液 2 mL，0.5 mL 酶液，對照只加入0.5 mL PAL 酶提取液。40℃水浴30 min，在290 nm處測吸光度值，以O(shè)D290 nm值變化0.01為一酶活力單位，重復(fù)4次。

1.2.4 POD 活性的測定

POD采用愈創(chuàng)木酚法測定，參照袁慶華等［10］的方法。稱薇甘菊葉片0.25 g，液氮研磨后轉(zhuǎn)入離心管，加2.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2，內(nèi)含5% 聚乙烯基吡咯烷酮)，振蕩10 s，12 000 r/min離心15 min，取上清液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诒壬幸来渭尤? mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)，1 mL 0.1 mol/L愈創(chuàng)木酚，1 mL 0.8%H2O2，50 μL酶液后迅速用封口膜封口搖勻，在470 nm處測吸光度值，記錄0—120 s的OD470值，每10 s記錄1次，重復(fù)4次。

1.2.5 PPO 活性的測定

PPO測定參照朱廣廉［19］的方法，略有改進(jìn)。稱取薇甘菊葉片0.25 g，液氮研磨后轉(zhuǎn)入離心管，加入少量預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.8，內(nèi)含5% 聚乙烯基吡咯烷酮)，振蕩10 s，12 000 r/min離心15 min，取上清液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谠嚬苤屑尤?.9 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.8);1 mL 0.05 mol/L兒茶酚溶液;0.1 mL酶液。37℃ 15 min，迅速轉(zhuǎn)入冰浴并加入2 mL 20%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，在525 nm處測吸光度值，重復(fù)4次。

1.2.6 葉綠素含量的測定

參照舒展等［20］的方法，稱0.1 g薇甘菊葉片放入研缽中，加少量石英砂研磨成糊狀，用80%的丙酮水溶液分批提取葉綠素，直至殘渣無色為止。將丙酮提取液過濾后定容，分別在663、645和440 nm處測吸光度值。根據(jù)下列各式計算出葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量，葉綠素a/b的比值［21］，重復(fù)4次。

1.2.7 光合作用參數(shù)測定

用LI-6400便攜式光合儀(LI-COR，Nebraska，USA)測定MMWV侵染32d后及健康對照薇甘菊葉片在8:00—11:30的光響應(yīng)曲線，測定時光強(qiáng)梯度由強(qiáng)到弱，依次設(shè)定光量子通量密度(photon flux density，PFD)為1500、1000、800、600、400、200、100、80、40、20和0 mmol·m－2·s－1，葉室溫度設(shè)置為25℃，測定時將參比室的CO2濃度穩(wěn)定在 380 μmol·mol－1，在每個光梯度下平衡 180 s后測定凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)［22］。每株測定頂端第5片葉子，重復(fù)5次。依據(jù)Bassman和Zwier［23］的方法擬合Pn-PFD曲線，計算最大凈光合速率(Maximal net photosynthetic rate，Pmax)、表觀量子效率(Apparent quantum yield，AQY)、暗呼吸速率(Dark respiration rate，Rd)、光飽和點(Light saturation point，LSP)和光補(bǔ)償點(Light compensation point，LCP)。模型的參數(shù)通過SPSS 16.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)的非線性評價模型進(jìn)行計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 16.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用獨立樣本t檢驗分析MMWV侵染對薇甘菊葉片光合特性的影響，所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 MMWV侵染對SOD、POD、PPO和PAL活性的影響

從圖1可以看出，健康對照薇甘菊葉片內(nèi)SOD活性保持相對穩(wěn)定，接種MMWV后，薇甘菊葉片中SOD活性在接種后8—16d分別比對照提高了19.20%和14.19%。而接種MMWV 24—32d后，薇甘菊葉片內(nèi)SOD活性逐漸減低，其中第32天達(dá)到最低值，比對照減低了25.37%。接種MMWV后引起薇甘菊葉片內(nèi)POD活性發(fā)生明顯變化。接種8d后，POD活性比對照逐漸升高，第24天達(dá)到最大值，比對照增加了41.12%，24d后POD活性有下降的趨勢，但仍顯著高于對照組。薇甘菊接種MMWV 8d后，葉片內(nèi)PPO活性達(dá)到最大值，比對照顯著增加了77.75%。接種后16—32d PPO活性總的變化趨勢與健康對照組基本一致。接種MMWV 8d后，薇甘菊葉片中PAL活性比對照顯著增加了23.58%。隨后接種薇甘菊葉片內(nèi)PAL活性開始降低，之后PAL活性又升高，第24天再達(dá)峰值，即PAL活性曲線有2個酶峰。第32天感病葉片內(nèi)PAL活性比對照顯著減低了20.53%。

2.2 MMWV侵染對薇甘菊葉片葉綠素含量的影響

健康對照薇甘菊葉片中的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量、葉綠素a/b保持相對穩(wěn)定。受MMWV侵染的薇甘菊葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量自接種后第8天開始緩慢下降，至32d后下降幅度最大。MMWV侵染薇甘菊32d后，薇甘菊葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量、葉綠素a/b分別比對照組減少了 30.76%，18.76%，26.41%和 17.84%(圖 2)。

2.3 MMWV侵染對薇甘菊葉片光合特性的影響

MMWV侵染對薇甘菊葉片的Rd，LCP和AQY無顯著影響，其中MMWV侵染使葉片的LCP比對照增加17.53%。MMWV侵染薇甘菊使其葉片的Pmax和LSP分別比對照顯著減少32.34%和12.52%，表明MMWV侵染可影響薇甘菊葉片的光合效率(表1)。

表1 MMWV侵染對薇甘菊葉片光合參數(shù)的影響Table 1 Photosynthetic parameters in the leaves of Mikania micrantha after infection by MMWV

圖1 MMWV侵染對薇甘菊葉片中SOD、POD、PPO、PAL活性的影響Fig.1 Changes of SOD，POD，PPO and PAL activities in the leaves of M.micrantha after infection by MMWV

3 討論

研究表明病毒侵染可引起寄主植物體內(nèi)SOD，POD，PPO等與植物抗病性相關(guān)的酶活性變化［7-8，10，24-26］。野生大豆(Glycine max)的PPO和PAL活性與對大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus，SMV)的抗性呈顯著正相關(guān)，可利用葉片中PPO和PAL活性水平作為野生大豆病毒病抗性鑒定的參考指標(biāo)［8］。研究發(fā)現(xiàn)煙草接種黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)的PE、M和Xb等3種毒株后，Xb和M毒株可引起SOD活性前期升高、后期活性下降;M毒株導(dǎo)致PAL活性一直保持在較高水平，而PE毒株則導(dǎo)致PAL活性下降。PE和M毒株均導(dǎo)致POD酶活性升高［7］。本實驗結(jié)果顯示MMWV侵染薇甘菊前期可誘導(dǎo)SOD、POD、PPO和PAL活性提高，尤其是PPO活性比健康對照增加了77.75%。隨著侵染時間的增加，感病薇甘菊葉片中SOD、PPO和PAL的活性逐漸降低，而POD的活性則保持相對較高的水平(圖1)。同理黃瓜(Cucumis sativus)苗期感染黃瓜枯萎病(Fusarium axysporum f.sp.cucumerinum Owen)后，葉片組織中POD，SOD，PPO活性變化曲線存在2個酶峰，PAL活性變化曲線存在1個單峰;其中抗病品系的POD和PAL活性的提高與抗性呈顯著正相關(guān)，而SOD和PPO活性的提高與抗性呈極顯著正相關(guān)［9］。

病毒侵染寄主植物后，在細(xì)胞內(nèi)大量地復(fù)制、增殖可破壞寄主細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)和功能使葉綠素含量下降［23，27］，導(dǎo)致寄主植物的光合作用效率降低甚至死亡［1，5-16，28］。番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)侵染可導(dǎo)致番茄(Lycopersicon esculentum)葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量、凈光合速率和氣孔導(dǎo)度分別比健康植株下降50.2%、24.19%、43.84%、43.28%和27.07%［2］。馬鈴薯 Y 病毒(Potato virus Y，PVY)侵染馬鈴薯(Solanum tuberosum)60d后，侵染葉片中的凈光合速率、葉綠素含量和電子傳遞速率分別減少了49.4%、40.2%和 72.9%［4］。蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)侵染青菜(Brassica chinensis)和芥菜(Brassica juncea)后導(dǎo)致寄主葉片的葉綠素含量、光合速率、蒸騰速率明顯降低［3］。蠶豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2，BBWV 2)B935和PV131侵染蠶豆(Vicica faba)使感病蠶豆葉片中葉綠素含量減少，葉綠素a/b值逐漸降低［29］。本研究結(jié)果顯示MMWV侵染薇甘菊32d后使葉片中葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量顯著減低(圖2)，同時葉片中Pmax和AQY分別比對照顯著降低了32.34%和12.52%(表1)。表明MMWV侵染可影響薇甘菊葉片中葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致葉片光合效率降低。病毒侵染導(dǎo)致寄主的葉綠素含量降低是由于葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞所致［27］，碳同化酶活性下降，可能是造成光合作用速率降低的主要原因［4，30-31］。

圖2 MMWV侵染薇甘菊后不同時間階段葉片中葉綠素含量Fig.2 Chlorophyll contents in the leaves of Mikania micrantha at different stages after infection by MMWV

目前防治薇甘菊的措施主要有4種即人工清除、化學(xué)防除、生物防治和生態(tài)控制［11］。人工清除適用于薇甘菊危害面積較小的區(qū)域，大面積人工清除費時費力且易復(fù)發(fā)。化學(xué)防除易造成環(huán)境污染，薇甘菊可能在數(shù)年后再次為害。生物防治是利用薇甘菊的病原微生物和天敵昆蟲(真菌、細(xì)菌、病毒、螨類等)進(jìn)行控制。Ellison等［32］發(fā)現(xiàn)薇甘菊柄銹菌Puccinia spegazzinii僅侵染薇甘菊屬植物。安婀珍蝶(Actinote anteas)［33］、紫紅短須螨(Brevipalpus phoenicis)［34］和小蓑蛾(Acanthophyche sp)［35］等可取食薇甘菊的莖葉。田野菟絲子(Cuscuta campestris)可控制薇甘菊生長，但不能根除薇甘菊［11］。生態(tài)控制目前主要是利用幌傘楓(Heteropanax fragrans)［11］和芒萁(Dicranopteris pedata)［36］等本地物種控制薇甘菊的生長。發(fā)現(xiàn)和利用天敵控制外來入侵生物作為新興的方法值得做深入的研究［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)MMWV侵染薇甘菊30d后，其莖的長度、根、莖和葉的鮮重分別比健康對照植株減少了75.3%、75.6%、79.5% 和91.6%，MMWV可抑制薇甘菊的生長［16］。當(dāng)前，薇甘菊的防治仍是世界性難題，研究所發(fā)現(xiàn)的天敵雖可使薇甘菊致病甚至死亡，但在實際應(yīng)用中控制薇甘菊的擴(kuò)散尚未見報道［11，15，37］。

本研究表明MMWV通過降低薇甘菊葉片的光合特性和與抗病性相關(guān)的酶活性，從而抑制薇甘菊的生長。雖然該病毒有望被用來進(jìn)行薇甘菊的生物控制，有關(guān)生態(tài)風(fēng)險評價尚需深入研究。

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