大明竹屬遺傳多樣性ISSR分析及DNA指紋圖譜研究

黃樹軍，陳禮光，肖永太，榮俊冬，黃 婷，何天友，鄭郁善，，*

(1.福建農林大學林學院，福州 350002;2.福建農林大學園林學院，福州 350002)

大明竹屬(Pleioblastus)隸屬竹亞科(Bambusoideae)，主要分布東南亞，目前已發表的學名有100余種，我國有20余種，零散分布，長江中下游居多［1］。該屬竹筍可食，但味苦，竹竿通直壁厚，可作毛筆桿、傘柄、支架等用。一些竹如川竹［P.simonii(Carriere)Naka］、大明竹［P.gramineus(Bcan)Nakai］等的形態優美，被廣泛用于園林綠化及庭院景觀。該屬的生態和經濟價值越來越受人們關注。

竹類植物的生長發育規律都較為特殊，以花、果實等形態為主的傳統植物分類方法對竹子分類復雜困難，竹子分類不一［2-4］，在學術上頗有爭議［5］。隨現代分子生物技術的飛速發展，分子標記技術在竹子分類及遺傳多樣性研究得到了廣泛應用［6-11］，分子標記可檢測部分竹種的基因差異，在分子水平上輔助分類［12］，助于解決分類爭議，對鑒定種質資源起重要作用。近年來，常用的分子標記有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SNP等。簡單重復序列間擴增(ISSR)是由Zietkiewicz提出，有較好的穩定性和多態性［13-14］，其技術要求低，操作簡便，成本低，是構建基因圖譜理想的分子標記技術。ISSR技術已廣泛應用于鑒定品種、分析遺傳多樣性、繪制指紋圖譜等研究領域［15-18］。目前大明竹屬的部分植物分類還存在爭議［19］，應用分子標記技術大明竹屬植物種間親緣關系的研究報道不多。本試驗利用ISSR技術分析大明竹屬25個種的遺傳多樣性，并用引物構建25個種的DNA數字指紋識別碼，為大明竹屬部分竹種分類提供相關依據。

1 材料和方法

1.1 材料

在福建農林大學百竹園取大明竹屬25個種含變種的嫩竹葉，每種取樣3—5株，用放變色硅膠的冰壺干燥保鮮，并速帶回置于-80℃低溫保存，以備提取DNA。ISSR引物為哥倫比亞大學公布的100條中經篩選對25個種具有較好多態性的18條(見表1)。25個竹種依次編號(1—25)為:長葉苦竹P.china f.hisauchii、大明竹 P.gramineus(Bean)Nakai、垂枝苦竹P.amarus(Keng)Keng f.var.pendulifolius S.Y.Chen、光籜苦竹 P.amarus(Keng)Keng f.var.subglabratus S.Y.Chen、慶元苦竹 P.qingyuanensis、白紋東根世 P.chino f.angustifolius、遂昌苦竹 P.suichangensis、白紋女竹 P.simonii f.albostriatus、硬頭苦竹 P.longifimbriatus S.Y.Chen、橙綠鞘苦竹 P.dokgyoamus、油苦竹 P.oleosus Wen、杭州苦竹 P.amarus var.(Keng)Keng f.var.hangzhouensis S.L.Chen et S.Y.Chen(accepted name)、苦竹 P.amarus(Keng)Keng f.、黃條金剛竹 P.kongosanensis f.aureostriaus、秋竹 P.gozadakensis Nakai、仙居苦竹 P.hsienchuensis Wen、云和苦竹 P.yunhoensis、斑苦竹 P.maculates(McClure)C.D.Chu et C.S.Chao、衢縣苦竹P.juxianensis Wen、華絲竹P.intermedius S.Y.Chen、麗水苦竹 P.maculosoides Wen、宜興苦竹 P.yixingensis S.L.Chen et、實心苦竹 P.longifimbriatus S.Y.Chen、螺節竹 P.graminens f.manstopiral、皺苦竹 P.rugatus Wen et S.Y.Chen。

1.2 主要試劑和儀器

l0×PCR Buffer、DNA ladder Marker、dNTPs Mixture(各2.5 mmol/L)、ISSR 引物、Taq DNA 聚合酶、RNA 酶、MgCl2、瓊脂糖(Agarose)等購于上海生工生物工程技術服務有限公司(Sangon);核酸染料Gold View購于上海賽百盛公司;液氮購于福建省福州市第二化工廠;乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)、三羥基氨基甲烷(Tris)、硼酸、溴酚藍、無水乙醇、蔗糖等為國產分析純。主要實驗儀器為:圣歐國際有限公司的LabCycler PCR、上海培清科技有限公司的JS-680全自動數碼凝膠成像分析儀、北京六一儀器廠DYY-8C電泳儀等。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取

大明竹屬DNA的提取采用杭州博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒(Cat#BSCl3S1)，在含有Gold View核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳，緩沖液為1×TBE，電泳電壓為5 V/cm，電泳時間30 min，并用凝膠成像分析儀檢測DNA的完整性。用紫外分光光度計測定DNA純度及濃度。顯示DNA質量完好，條帶明亮清晰完整，純度合格，滿足試驗要求，于-20℃冰箱保存。

1.3.2 ISSR-PCR反應體系和擴增程序

查閱資料［20］，PCR 設定反應體積 20 μL，40 ng 模板 DNA、0.5 μmol/L 引物、0.5 mmol/L dNTPs、2 μL 的10×PCR Buffer、1.0 U Taq DNA聚合酶、2.0 mmol/L Mg2+。篩選時所應用的擴增程序固定為:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸90 s，循環40次，72℃延伸7 min，4℃結束。以大明竹DNA樣品為模板，利用UBC811引物優化ISSR擴增體系。以設定的原初體系為基礎，單因素設計不同梯度的Mg2+、Taq DNA、引物、dNTPs、模板DNA濃度，每次改變其中某一因素優化其體系。

經篩選，確定大明竹屬部分植物的ISSR-PCR反應體系為20 μL體系:2 μL的l0×Buffer;0.15 mmol/L的dNTPs;0.5 μmol/L的引物;2.5 mmol/L 的 MgCl2;50 ng/20μL 的模板 DNA;1.0 U 的 Taq DNA 聚合酶;10.6 μL的滅菌ddH2O。其ISSR擴增程序為:94℃預變性5 min，94℃變性60 s，55℃復性45 s，72℃延伸90 s，循環40次，72℃延伸7 min，4℃結束。PCR產物檢測用1.5%瓊脂糖凝膠電泳1 h，電壓80 V，核酸染料染色，在紫外凝膠成像分析儀拍照觀察。

1.3.3 ISSR有效引物的篩選及反應體系的檢驗

用100條隨機引物對任意一份DNA樣品在優化的反應體系及擴增程序擴增以篩選引物，引物需符合(1)條帶清晰，不模糊，不彌散;(2)空白中無或少假帶;(3)對所有樣品均有質量好的條帶。最后，以25種竹子的DNA作為模版，用篩選的18條引物檢驗有效引物及反應體系(圖1)。

圖1 大明竹屬植物ISSR部分引物篩選圖Fig.1 Preliminary seletion of some ISSR primers on Pleioblastus

1.4 ISSR條帶分析與數據統計

ISSR條帶分析結果的記錄過程，不能只依據帶的強弱取舍位點，位點的帶應具較好的可重復性，對弱帶的處理方式為:若重復性好，僅因升高退火溫度而消失，則視為退火位點不完全匹配造成，可記錄;而弱帶無規律可能為產物間退火、非專一性擴增或其他人為因素導致，不可記錄。

采用Jaccard公式計算不同物種間隨機擴增多態DNA片段相似性:F=2Nxy/(Nx+Ny)，式中F為共享度，Nxy為物種X和物種Y共有的DNA片段數，Nx和Ny分別為物種X和物種Y的DNA片段數，任意兩物種間的遺傳距離(P)根據其共享的ISSR片段相似性D來計算，D=-lnF［21］。

ISSR擴增帶用“1”和“0”表示有或無，建立數據庫。利用DPS 7.05軟件統計分析，根據遺傳距離(P)采用UPGMA類平均法進行聚類分析，建立分析樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 大明竹屬25種竹不同引物的ISSR標記多態性分析

利用篩選的18條引物對25種竹ISSR分析，引物的堿基序列如表1所示。多態位點百分率是衡量一個群體內遺傳變異水平高低的重要指標，某群體的比值若高，則說明該群體的環境適應性強;反之則弱，經長期進化容易被淘汰。18條引物在供試樣品中共擴增出155個位點，其中多態位點137個，每個引物平均擴增8.61個位點，多態位點有7.61個，多態位點占擴增位點88.3%。說明大明竹屬種間有較大的遺傳差異，該屬作為一個群體具有強的環境適應能力。18條引物對25種竹共擴增條帶1816條，每條引物平均擴增條帶100.88條，部分引物擴增如圖2—圖3所示。擴增的DNA片段分子量在160—3000 bp之間。

表1 大明竹屬ISSR分析引物Table 1 The sequence of ISSR primers on Pleioblastus

圖2 引物U807對25個大明竹屬樣品的ISSR擴增電泳圖譜Fig.2 The 25 samples for Pleioblastus amplified by ISSR U807

圖3 引物U810對25個大明竹屬樣品的ISSR擴增電泳圖譜Fig.3 The 25 samples for Pleioblastus amplified by ISSR U810

2.2 大明竹屬部分竹類種間遺傳距離及遺傳多樣性分析

通過比較擴增條帶有無、數量及帶型差異來分析種間的遺傳多樣性及親緣關系。差異條帶數量多，帶型變化大，說明竹種間的遺傳距離大，遺傳多樣性豐富，親緣關系則較遠，反之，遺傳距離就小，親緣關系則近。親緣關系可通過遺傳距離(0—1之間)來判定，若為1，則親緣關系完全一樣，若為0則無親緣關系。依據18條引物擴增結果，量化基因組指紋圖譜為數據矩陣，用Jaccard公式計算種間的遺傳距離(表2)。大明竹屬25種竹的平均遺傳距離為0.5006，變異幅度在0.1486—0.7191之間，其遺傳距離的平均值及變異幅度均較高，說明大明竹屬具有較高的遺傳多樣性，表明該屬在遺傳進化過程，受各類因素影響，或地理位置變遷，或氣候變化，種間的基因組DNA發生了變異，從而構成豐富的基因庫。從DNA水平分析，若種間遺傳距離的變異幅度大，則說明其遺傳分化大，遺傳多樣性高，遺傳背景復雜，該屬的遺傳距離大多在0.5范圍內，說明了該屬在遺傳上的相對穩定性。表2可知同一竹種的變種的種間遺傳距離小，不同種的種間遺傳距離較大，大明竹亞屬中的長葉苦竹、大明竹、螺節竹與苦竹組有較大的遺傳距離，川竹亞屬苦竹組的種間遺傳距離小。種間遺傳距離顯示，大明竹屬25種竹的親緣關系與形態分類的分類結果基本一致，說明該形態分類方法比較合理，且用ISSR分析在分子水平檢測該屬部分植物的種間遺傳多樣性較為可靠。

2.3 大明竹屬25種竹的聚類分析

對擴增結果形成的基因型原始數據矩陣，運用DPS 7.05軟件分析大明竹屬親緣關系，根據遺傳距離采用Nei_Li最長距離法聚類分析，建立聚類分析樹狀圖(圖4，表3)。

聚類結果表明:大明竹、長葉苦竹的遺傳距離最近0.1618，先聚為第一類;在0.3662處宜興苦竹、螺節竹聚為一起，并在0.4702處與麗水苦竹聚為第二類;在0.1618處同為苦竹變種的垂枝苦竹和光籜苦竹聚為一起，并在0.3665處與慶元苦竹聚為一枝;白紋東根世、白紋女竹在0.1750處聚在一起，并在0.3124處與遂昌苦竹聚為一枝;上述兩枝在0.4332處聚為一枝;在0.2113處硬頭苦竹、櫈綠鞘苦竹聚在一枝;在0.3319處，杭州苦竹、苦竹、黃條金剛竹、秋竹聚為一枝;在0.4286處實心苦竹與皺苦竹聚為一枝;在0.4337處，油苦竹、云和苦竹、衢縣苦竹、斑苦竹、華絲竹、仙居苦竹聚為一枝;以上幾枝最終在0.5396處合聚為第三類。在圖4畫線處(0.5396)可將25種竹劃分為3組，即第1組遺傳距離為0.1618:長葉苦竹和大明竹;第2組遺傳距離為0.4702:麗水苦竹、宜興苦竹及螺節竹;第3組遺傳距離為0.5634:垂枝苦竹、光籜苦竹、慶元苦竹、白紋東根世、白紋女竹、杭州苦竹、苦竹、硬頭苦竹、櫈綠鞘苦竹、黃條金剛竹、秋竹、云和苦竹、衢縣苦竹、斑苦竹、遂昌苦竹、華思竹、油苦竹、仙居苦竹、實心苦竹和皺苦竹。

圖4 25個大明竹屬竹種間的聚類樹狀圖Fig.4 Dendrogram of the cluster of 25 bamboo species of Pleioblastus based on ISSR markers

表3 大明竹屬植物個體的聚類次序及距離Table 3 Clutering order and genetic distance of the 25 bamboo species of Pleioblastus

2.4 大明竹屬25種竹基于ISSR技術的DNA數字指紋識別碼

研究得出用U807、U815及U835可鑒定大明竹屬25個竹種，還可與有較高多態性的U836、U840、U841和U844的4條引物共同構建大明竹屬25種竹的DNA數字指紋識別碼(表4)，可用于鑒別大明竹屬部分竹類的分類。

3 結論與討論

研究共擴增出重復性好的多態位點高達88.3%，平均每個引物擴增8.61個，DNA分子量在160—3000 bp，大明竹屬25種竹子的平均遺傳距離為0.5006，變異幅度為0.1486—0.7191，說明大明竹屬具有高的遺傳多樣性，種間遺傳相對復雜。ISSR聚類分析結果，在遺傳距離0.5396處將25種竹劃分為3類，與形態分類結果大致一致。第3組大多竹種的遺傳距離小于0.5(表3)，其表現出穩定的遺傳性狀，它們均為中國植物志傳統分類學的川竹亞屬苦竹組竹種，其中同為苦竹變種的垂枝苦竹和光籜苦竹在0.1618處相聚，苦竹和苦竹的變種杭州苦竹在0.1806處相聚，表現出較高的遺傳相似性。大明竹、長葉苦竹和螺節竹都為大明竹亞屬，和川竹亞屬苦竹組存在著較大的遺傳差異，其中大明竹和長葉苦竹親緣關系非常接近。楊光耀［22］用RAPD研究認為，宜興苦竹與苦竹關系密切，大明竹與長葉苦竹、苦竹、斑苦竹、宜興苦竹親緣關系較遠，本研究則認為大明竹與長葉苦竹關系密切，宜興苦竹與苦竹組未聚一起，與其觀點不一致。在傳統分類學中，麗水苦竹和宜興苦竹同屬于川竹亞屬苦竹組，但并未與苦竹組竹種相聚在一起，此結果有可能是因為竹種發生變異導致，或是人為因素促使，其具體原因及機理有待進一步研究。雖然大明竹屬有些竹種未與其變種相聚在一起，劃分在其他亞屬里，但傳統形態分類與聚類分析結果大致吻合，說明ISSR分析大明竹屬部分竹類種間或種內的親緣關系及遺傳多樣性較為精確可靠，有助于該屬的分類。試驗結果多態性豐富，說明大明竹屬具有高的遺傳多樣性，其種間遺傳相對復雜，而ISSR技術能靈敏精確檢測多樣遺傳。試驗用U807、U815、U835、U836、U840、U841、U844共7個引物建立大明竹屬25個竹種的數字指紋識別碼，為鑒定大明竹屬提供相應依據。

表4 25個大明竹屬竹種的數字指紋碼Table 4 Fingerprints of the 25 provenances resources of Pleioblastus by ISSR

利用形態學、細胞學及分子標記等手段對竹類分類研究已有一定成果，但還存在較多分歧。分子標記也具有一定的局限性，ISSR是繼SSR后發展的新技術，其重復性及穩定性高，被廣泛用于分析遺傳多樣性及鑒定品種等方面。本研究利用ISSR技術對大明竹屬部分竹種初步探究，分子技術在竹類領域的研究還值得繼續探索。利用分子標記開展竹種間分子水平上遺傳變異研究，結合形態分類，對竹類辨別分類，能夠更好地鑒定與解決某些種屬分類混亂問題，研究遺傳多樣性等，為竹子分類提供分子依據，使分類更加合理。隨生物技術不斷發展，竹類研究也將運用生物技術解決更多難題，竹類的基因組研究、基因機理、轉基因技術和克隆技術，都將成為竹類研究的新方向。

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