糖痹顆粒對糖尿病模型大鼠坐骨神經NGF及SP表達的影響

謝 勤，渠利華 ，陳曉雯

（1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230011；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031）

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病臨床上常見的慢性并發癥之一，該病的病理基礎是以高血糖為中心的各種代謝異常和微循環障礙等多種因素而導致的周圍神經損傷。糖尿病病程超過10 a，半數以上的患者會合并不同程度的周圍神經病變，其發病率隨著年齡增長而逐年升高［1］。DPN發病機理尚未完全闡明，神經營養障礙在DPN中的影響機制日益受到人們的關注，目前研究也比較多?，F代醫學對于DPN的治療以藥物治療為主，但缺乏特異性治療方法。目前，中藥復方干預DPN神經營養障礙機制的研究越來越受到重視，特別是對神經營養因子及相關神經肽的研究較多，并且取得了一定的成果。本實驗主要研究中藥復方制劑糖痹顆粒對糖尿病大鼠坐骨神經神經生長因子（nerve growth factor，NGF）及其表達產物 P 物質（substance P，SP）的影響，探討糖痹顆粒干預DPN神經營養障礙的可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級6周齡雄性SD大鼠36只，體重180～220 g，由安徽省實驗動物中心提供［動物許可證號：SCXK（皖）2011-002］。

1.2 實驗試劑及藥物 糖痹顆粒：由黃芪10 g，生地黃 10 g，川芎 6 g，赤芍 10 g，紅花 5 g，桃仁 10 g，全蝎3 g，延胡索10 g，僵蠶10 g等組成（廣州一方制藥廠生產）；兔抗鼠NGF多克隆抗體（巴傲得生物科技有限公司，批號：K0151）；兔抗鼠SP多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：990885W）；SP kit（即用型）及DAB顯色液（北京中杉生物技術有限公司，批號：K136719H）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司生產，北京索來寶科技有限公司分裝，批號：20120124）。

1.3 實驗主要器材 切片機（Leica RM2135，德國LEICA 公司）；顯微鏡（Nikon 80i，日本 Nikon 公司）；自動脫水機（亞光ZT-12M，湖北孝感亞光醫用電子有限公司）；石蠟包埋機（亞光YB-7B，湖北孝感亞光醫用電子有限公司）；干燥箱（精宏DHG-9140A，上海精宏實驗設備有限公司）；冰箱（榮事達BCD-245F，安徽合肥榮事達股份有限公司）；JEM-1230型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）。

2 實驗方法

2.1 造模及分組 參照徐雁方法造模［2］。選擇清潔級成年雄性SD大鼠36只，體重180～220 g，每籠5只，溫度（20±2）℃，濕度 55%～65%，自由飲水，12 h晝夜周期喂養，普通標準飼料適應性喂養1周后，隨機分為正常組、模型組、糖痹顆粒組各12只。模型組和糖痹顆粒組禁食12 h后，將鏈尿佐菌素臨用前用0.l mmol／L 檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.3，4℃）避光條件下配成1%濃度溶液，按50 mg／kg劑量左下腹腔內單次注射，72 h后尾靜脈取血，用貝朗血糖測試儀測量血糖，血糖＞16.7 mmol／L者確定成模納入試驗。正常組予以注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。

2.2 給藥方法 成模第2天，各組大鼠均予以普通標準飼料喂養8周，同時各組給藥如下：糖痹顆粒組大鼠每日生藥量根據《中藥實驗方法學》按成人劑量換算為 1.2 g／（kg·d-1）灌服糖痹顆粒，以生理鹽水溶解，每日1次，連續給藥8周，每2周記錄1次體重、血糖；正常組、模型組灌服相同比例體積的生理鹽水，每日1次，連續8周，每2周記錄1次體重、血糖。

2.3 取材 末次給藥后，大鼠禁食不禁水13～14 h，以10%水合氯醛作腹腔麻醉，根據大鼠體重，注射劑量按350 mg／kg。麻醉成功后，用鋒利剪刀近端從坐骨神經切跡處剪斷，遠端從腓脛神經分叉處剪斷，置于中性甲醛中固定，而后石蠟包埋，橫斷面切片，用于免疫組化檢測。同法另取一段坐骨神經，戊二醛、鋨酸固定后脫水、包埋，超薄切片，用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡下觀察其超微結構并拍照。

2.4 檢測方法

2.4.1 一般情況觀察 每2周記錄1次各組實驗大鼠體重、飲水量、尿量、血糖等一般情況。

2.4.2 透射電鏡觀察 電鏡下觀察各組大鼠坐骨神經纖維結構，在高倍鏡下拍片，主要觀察神經纖維的結構、排列，髓鞘的厚度、形態及板層結構，雪旺細胞的形態、軸突及其內部微絲、微管、線粒體等結構有無變化。

2.4.3 免疫組化檢測 ①石蠟切片（Leica RM2135，厚度2 μm）常規脫蠟至水，PBS洗3次各2 min，將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），微波爐加熱至沸騰后斷電7 min左右，間隔2～3 min后，再加熱2～3 min，水浴冷卻至室溫。② 滴加3%H2O2，室溫靜置10～15 min，PBS洗3次各3 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫靜置30 min，以減少背景的非特異性顏色，傾去勿洗。③ 依次滴加兔抗鼠1∶250稀釋的NGF抗體（另取同一標本切片，P物質抗體的稀釋度為 1∶200）50 μL／片，4℃過夜， 過夜后需在37℃復溫10～20 min，PBS洗3次，每次5 min。④滴加Ⅱ抗工作液 50 μL／片，37 ℃孵育 30 min，PBS洗3次各5 min；加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液50 μL／片，PBS 洗 3 次各 5 min。⑤ DAB 顯色 5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，自來水沖洗，蘇木精復染1 min，鹽酸酒精分化數秒；自來水沖洗15～20 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片、烤片。⑥ 在高倍視野（40×10）下觀察并拍照，神經纖維軸突橫斷面出現特異性的棕黃色顆粒者為陽性，空白對照依舊為淺藍色。每張切片觀察5個高倍視野，采用JD801圖像分析軟件計算其光密度值（optical density，OD）。

2.5 統計學處理 全部數據用SPSS 17.0軟件包進行統計學處理。連續型變量采用±s表示，同組治療前后均數比較采用配對t檢驗，組間比較用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 大鼠一般情況的變化 造模成功后，模型組大鼠均有不同程度的尿量增多，飲水量及進食量增加，活動減少，體重下降，精神不振，體毛缺乏光澤，并出現多種糖尿病相關并發癥；糖痹顆粒組大鼠的上述情況較模型組有不同程度的改善；正常組大鼠飲水量、進食量、尿量、體重等一般情況均正常。與正常組大鼠比較，模型組、糖痹顆粒組大鼠在2周、4周、8周的空腹血糖值均明顯升高，有非常顯著性差異（P＜0.01）；與模型組比較，糖痹顆粒組第8周的大鼠血糖顯著下降（P＜0.01），第 2、4周比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。說明糖痹顆粒有降低DPN大鼠血糖的作用，見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖比較（±s）mmol／L

表1 各組大鼠空腹血糖比較（±s）mmol／L

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組 別正常組模型組糖痹顆粒組n 大鼠血糖2周4周8周1210115.48±0.7125.01±3.991）24.44±3.801）5.47±0.6825.86±3.991）22.53±3.391）5.43±0.8326.02±3.791）20.61±2.721）2）

3.2 大鼠坐骨神經超微結構 透射電鏡下觀察正常組大鼠（圖1A）有髓纖維形態規則，髓鞘呈板層樣結構，軸突可見神經微絲、微管等細胞器。模型組大鼠（圖1B）有髓神經纖維髓鞘結構嚴重松散、紊亂，板層分離明顯，可見指紋樣病變以及蜂窩狀結構，多個神經纖維髓鞘有水腫和崩解碎片，部分髓鞘出現斑塊狀脫失和節段性脫髓鞘；有髓神經纖維軸索萎縮、變性，細胞器顯示不清，無髓神經纖維線粒體嵴減少，可見毛細血管擴張，充血。糖痹顆粒組大鼠（圖1C）神經纖維髓鞘病變較模型組明顯減輕，軸突稍萎縮，內可見微絲、微管等結構，髓鞘有輕微分離現象及斑片狀變化。

圖1 各組大鼠坐骨神經超微結構（×8000）

3.3 大鼠坐骨神經免疫組化結果 NGF陽性表達主要為神經元軸突、髓鞘染成棕黃色顆粒，軸突表達較多，髓鞘表達較少。其中正常組大鼠坐骨神經纖維軸突及髓鞘NGF表達較多；模型組大鼠神經纖維NGF表達很弱，模型組平均光度值明顯低于正常組（P＜0.01）；糖痹顆粒組大鼠神經纖維NGF的表達較模型組有所上調（P＜0.05），但與正常組比較有所下降（P＜0.05）。SP的表達與NGF大致相同，主要在神經元的軸突及髓鞘，表達量的變化趨勢與NGF相似。實驗結果表明：糖痹顆粒有上調糖尿病大鼠坐骨神經NGF及SP表達的作用，見表2、圖2-7。

表2 NGF及SP的光度值（±s）

表2 NGF及SP的光度值（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05。

組 別正常組模型組糖痹顆粒組NGF（OD）0.492±0.0560.391±0.0612）0.441±0.0281）3）n 121011 SP（OD）0.351±0.0480.241±0.0582）0.298±0.0471）3）

圖2 正常組大鼠神經纖維NGF表達呈強陽性（×400）

圖3 糖痹顆粒組大鼠神經纖維NGF表達較弱（×400）

圖4 模型組大鼠神經纖維NGF表達很弱（×400）

4 討 論

DPN發病機理尚未完全闡明，現代醫學研究表明DPN的主要機制與代謝紊亂、氧化應激、血液流變性異常、神經營養因子缺乏、免疫因素等有關［3］。目前研究神經營養障礙對DPN的影響機制比較多。NGF是發現最早、研究最深入的一類生長因子，是胚胎感覺、交感神經生長發育必不可少的物質，對成年神經系統功能的維持及結構的完整也具有重要的作用［4］。NGF是交感神經元、感覺神經元和中樞部分膽堿能神經元生長、發育、存活、功能維持所依賴的營養因子。實驗研究［5］發現：糖尿病小鼠體內NGF水平降低，隨糖尿病病程進展，不同組織的NGF-mRNA進行性下降，尤其是小腿肌肉和坐骨神經，且坐骨神經中NGF mRNA的表達水平與其甩尾潛伏期呈負相關，與機械痛閾值呈正相關。動物實驗發現：給予外源性的NGF可以有效誘導損傷的神經再生，并維持外周神經屏障的通透性。糖尿病模型小鼠經NGF治療，坐骨神經神經纖維細胞中細胞骨架蛋白的密度顯著增加，從而促進了內皮細胞的緊密連接，維持了神經纖維的正常功能［6］。

圖5 正常組大鼠神經纖維SP表達呈強陽性（×400）

圖6 糖痹顆粒組大鼠神經纖維SP表達較弱（×400）

圖7 模型組大鼠神經纖維SP表達很弱（×400）

SP是一種合成受NGF調控的神經肽，有擴張血管、傳導痛覺等多種作用。SP分布于中樞和外周神經系統及其他組織中，SP作為一種對靶組織起興奮作用的介質，涉及痛覺傳遞，也是感覺神經元生長、發育、成熟的標志。SP廣泛分布于神經纖維內，能直接或間接通過促進谷氨酸等物質釋放參與痛覺傳遞。在周圍神經組織中，NGF可調節神經肽SP的表達，促進SP的發育。糖尿病模型大鼠坐骨神經中SP水平明顯降低，痛覺減退是糖尿病神經病變的典型癥狀，而傳導痛覺的介質神經肽SP的減少與痛覺減退相平行［7］。 賈軍宏等［8］觀察糖尿病模型大鼠坐骨神經SP的變化及NGF對其的影響，結果表明NGF可調節神經肽SP的表達，促進SP的發育，從而維持周圍神經的正常感覺功能。

DPN屬中醫消渴病日久而致的“脈痹”、“血痹”、“痿證”范疇。糖尿病以陰虛燥熱為本，日久耗氣傷陰，致氣陰兩虛，氣虛無力行血成瘀，陰虛燥熱煉液成痰，痰濁阻絡，血絡不通，“不通則痛”而為痹。DPN的病機總屬氣虛血瘀，氣血不能濡養四肢肌肉筋脈，而致肢體麻木疼痛、下肢拘攣。糖痹顆粒正是針對DPN“氣陰兩虛、痰瘀內阻”這一關鍵病機而組方的，全方具有益氣養陰、通絡止痛之功效。研究［9］表明：活血化瘀等中藥具有顯著的抗凝、溶栓、擴血管、降低血小板黏聚性及降低纖維蛋白原，改善血液流變性及微循環，并具有一定的軟化血管、增加血管通透性等作用，可減輕或消除血管內皮及神經細胞的充血水腫與玻璃樣變。實驗［10］顯示：糖痹顆粒能明顯改善DPN患者血液循環及血管功能，改善周圍末梢神經的缺血低氧狀態，提高神經傳導速度，使周圍神經獲得更多的營養，從而減輕周圍神經的損傷，使損傷的神經元得以恢復。

本實驗研究表明：糖尿病模型大鼠坐骨神經NGF和相關神經肽SP表達明顯減少。糖痹顆?？山档吞悄虿∧Ｐ痛笫蟮目崭寡?，有效改善糖尿病模型大鼠坐骨神經病理損傷程度，上調糖尿病模型大鼠坐骨神經NGF及SP的表達量，且主要在神經元的軸突及髓鞘的表達。因此，糖痹顆粒干預DPN神經營養障礙的作用機制可能是通過控制血糖，改善糖尿病大鼠坐骨神經血循環，緩解神經元的缺血、缺氧狀態，上調糖尿病模型大鼠坐骨神經NGF及SP的表達量，從而減輕神經元的損傷，促進損傷神經元的修復。

［1］VARKONYI T，KEMPLER P.Diabetic neuropathy.new strategies for treatment［J］.Diabetes Obes Meaty，2008，10（2）：99-108.

［2］徐雁，楊進.益腎通絡法對實驗性糖尿病大鼠周圍神經病變的保護機制［J］.上海中醫藥雜志，2009，43（9）：67-69.

［3］鐘美蓉，付秀美，付文亮，等.糖尿病周圍神經病變發病機制及中醫藥治療研究進展［J］.承德醫學院學報，2009，26（4）：438-440.

［4］張濤靜，高彥彬，周暉，等.糖絡寧對STZ誘導糖尿病大鼠血清 NGF含量及坐骨神經 NGF mRNA表達的影響［J］.江蘇中醫藥，2011，43（2）：81-83.

［5］ML，ANDREA M V，EVAL F.The role of growth factors iniabetic peripheral neuropathy［J］.Peri Nerv Sys，2004，9（1）：26-53.

［6］RENNO W M，SALEH F，KLEPACEK I.Talin immunogold density increases in sciatic nerve of diabetic rats after nerve growth factor treatment［J］.Medicina （Kaunas），2006，42（2）：147-163.

［7］GARRETT N E，KIDD B L，CRUWYS S C，et al.Streptozotocininduced diabetes decreases substance P levels in experimental arthritis in the rat knee［J］.Neurosci Lett，1995，187（3）：201-204.

［8］賈軍宏，馬學毅，田東華，等.神經生長因子對糖尿病大鼠背根神經節坐骨神經P物質變化的影響［J］.解放軍醫學雜志，1998，23（6）：420-422.

［9］熊麗麗，杜萬紅，陳澤奇，等.加味補肝湯對糖尿病周圍神經病變大鼠坐骨神經BDNF mRNA表達的影響［J］.現代生物醫學進展，2009，18（9）：3435-3438.

［10］陳曉雯，薛菲，李廷振.糖痹顆粒聯合甲鈷胺治療糖尿病周圍神經病變 27 例［J］.安徽中醫學院學報，2011，31（5）：10-12.