桑椹原花青素提取的響應曲面優化分析

袁 玲，李建華

(湖北工程學院 特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室,湖北 孝感 432000)

桑椹原花青素提取的響應曲面優化分析

袁 玲，李建華

(湖北工程學院 特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室,湖北 孝感 432000)

以桑椹原花青素的提取率為指標，利用中心組合設計(central composite design,CCD)優化桑椹原花青素超聲提取工藝。結果表明，建立的三次多項式數學模型是合適模型，優化提取工藝參數為：超聲功率315W，液料比60:1(mL/g)，提取時間12min。在該條件下桑椹原花青素的最優提取值是496.29 μg/g。經驗證，所得工藝參數準確，可指導桑椹原花青素的提取生產。

桑椹；原花青素；響應曲面分析；超聲波；提取工藝

桑椹(Mulberry)為多年生木本植物桑(MorusalbaL.)的成熟漿果。桑椹不僅營養價值高，而且還含有礦物質、氨基酸、維生素、黃酮、多酚等多種豐富的藥用成分，具有抗腫瘤、抗病毒、治療心腦血管疾病等作用[1]，被衛生部認定為“既是藥品，又是食品”的資源。桑椹的藥用成分及生物學活性越來越引起國內外學者的興趣。

原花青素(Procyanidins，PC)是一類聚多酚化合物的總稱，人體內不能合成，是一種良好的氧自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑，是迄今人類發現的最強、最有效的自由基清除劑之一[2]。具有抗氧化、抗生物突變等活性[3]，有很好的保健效果[4]。原花青素易溶于溫度50℃以上熱水及濃度為30%的乙醇[5]。已有少量以桑椹或桑椹果酒酒糟為原料，有機溶劑提取桑椹原花青素的工藝研究報道[6-7]。本文采用超聲水提法，對桑椹中的原花青素提取工藝進行優化，為桑椹原花青素的開發利用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1材料與試劑

試驗用桑椹采自湖北省孝感市朋興鄉，45℃烘干，粉碎過50目篩備用。原花青素標準品(中國藥品生物制品檢定所)。所用試劑正丁醇、硫酸鐵銨、濃鹽酸、甲醇、無水乙醇均為分析純。

1.2儀器與設備

Cary 60紫外可見分光光度計(安捷倫科技(中國)有限公司)；DL-480B智能超聲波清潔器(上海之信儀器有限公司)；SHZ-III循環水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；PL203電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)； HH-4數顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.3方法

1.3.1 確定檢測波長

準確配制質量濃度為0.50mg/mL的原花青素標準溶液，吸取0.3mL于10mL具塞比色管中，加入甲醇溶液至1.0mL，然后加入6.0mL正丁醇-鹽酸溶液(體積比為95∶5)和0.2mL質量分數為2%的硫酸鐵銨溶液(臨用時配制)，搖勻后，置沸水浴中加熱40min，然后迅速冷卻[8]，在波長400～700nm處進行掃描，確定其最大吸收波長。

1.3.2 標準曲線的繪制

吸取質量濃度為0.50mg/mL的原花青素標準溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL置于6支10mL具塞比色管中，各加入甲醇溶液至1.0mL，分別配成0，50，100，150，200，250mg/mL標準品溶液，在上述優化的條件下，測定其吸光值并繪制標準曲線。

1.3.3 試驗設計

使用Design-Expert軟件中的中心組合設計(Central Composite Design ，CCD)模塊中的二次回歸正交旋轉組合設計，設計了一組3因素5水平的共計20次的實驗(full CCD 設計)，其中析因部分實驗次數為14次，星點數為5，保證均一精密性的中心點重復次數手動調整為6，本試驗設計的因素及水平見表1。

表1 中心組合設計因素水平表

1.3.4 桑椹原花青素的提取與測定

準確稱取1.00 g干粉末，按照中心組合設計試驗中設置的不同提取條件，分別進行浸提、離心、抽濾，收集各個提取條件下得到的提取液以備用。各提取液按1.3.1中方法處理后，測定吸光值，計算樣品中原花青素的含量。

1.3.5 驗證與提取次數確定

在最優條件下提取桑椹原花青素并與預測結果進行比較(設置4個重復)，以確定優化模型預測的準確性；將第一次提取過濾所得的桑椹殘渣按同樣的條件再提取一次，以確定所需提取次數。

1.3.6 數據處理

用Cary 60紫外可見分光光度計分析系統自帶軟件繪制波長檢定曲線，用Excel軟件擬合標準曲線，用Design Expert 8.0軟件進行多元回歸及方差分析[9]。

2 結果與分析

2.1原花青素檢測波長的確定

將處理好的原花青素標準溶液倒入直徑為1cm的石英比色皿中，在Cary 60紫外可見分光光度計中從400nm到700nm進行掃描，掃描結果如圖1所示。

圖1 原花青素波峰檢測

從圖1可以看出，原花青素在可見光區有一明顯的吸收峰，波峰所在波長為550nm，因此鐵鹽催化比色法測定原花青素含量的檢測波長為550nm。

2.2標準曲線

圖2 原花青素標準曲線

以原花青素標準溶液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，得到原花青素標準曲線，如圖2所示。 Excel軟件計算得到回歸方程為y=0.0022x-0.0076，決定系數R2=0.9974，表明該回歸方程比較可靠。

2.3試驗結果

以超聲波功率、料液比、提取時間三個因素為自變量，20次試驗得到桑椹原花青素提取量(R)如表2所示。

2.4模型的建立與方差分析

利用Design-Expert軟件對試驗結果(表2)進行回歸及方差分析[10](分析結果見表3)，發現本研究符合三次方模型，經過響應曲面法的擬合計算得出該模型的決定系數R-Squared為0.9506，表明該模型具有較高的可信度；校正系數RAdj=0.8826 ，表明在原花青素含量總的變異中，有88.26%是由獨立變量引起的。失擬項不顯著，表明該模型能夠對桑椹原花青素的提取進行預測和分析。

表2 響應曲面分析試驗設計方案及結果

以超聲波功率、料液比、提取時間三個因素作為自變量，分別以A、B、C表示，原花青素提取量(R)為因變量， 即響應值，得優化的回歸方程為：R=541.27-1.97A-1.46B-7.06C+0.03AB+0.06AC+0.34BC+2.10A2-0.03B2-0.55C2-1.45ABC+0.01C3。R的物理意義是每克干桑椹提取原花青素的微克數。方程中各項系數絕對值的大小直接反應了各因素對響應值的影響程度。系數的正負反應了影響的方向。由回歸方程可知，料液比的線性項及功率、料液比的二次項對原花青素的提取率影響顯著。

表3 三次多項式模型方差分析表

2.5參數優化、驗證與提取次數

在Design Expert 8.0軟件的優化(optimization)模塊中，將優化標準設置為最大值800，求解得R的最優值是496.29μg/g，預測的最佳實驗條件為：超聲功率315W，液料比60:1(mL/g)，提取時間12min。為檢驗優化條件的準確性，按照上述優化得到的工藝參數，重復進行4次試驗，得其平均值為505.52μg/g，與預測值相差1.86%，表明實驗值與預測值基本吻合。

在最優提取條件下連續提取2次，發現桑椹原花青素第一次提取率可達84.6%，表明在此工藝條件下，桑椹原花青素的一次提取成功率較高。

3 結論

本研究以桑椹原花青素提取量為響應值，通過多元擬合方程，獲得了桑椹原花青素提取工藝中各影響因子的最佳提取參數。以水為溶劑，在超聲波功率為315W，液料比60:1，提取12min的工藝條件下，可從1g 烘干桑椹中提取原花青素496.29μg。驗證實驗表明，本文設計的工藝條件穩定，實驗值與預測值相差1.86%，基本吻合；在此工藝條件下，桑椹原花青素的一次提取率較高。而且，本工藝條件無污染、操作簡便，提取率高，在桑椹原花青素提取實踐中具有較高的參考價值。

[1] 吳祖芳,翁佩芳.桑椹的營養組分與功能性分析[J].中國食品學報,2005,5(3):102-107.

[2] 趙平,任鵬,張月萍.原花青素抗氧化活性測定方法比較[J].現代化工, 2012,32(5): 119-122.

[3] 張豐源.原花青素抗腫瘤作用及機制研究進展[J].重慶醫學, 2012,41(27): 2887-2888.

[4] 高羽,董志.原花青素的藥理學研究現狀[J].中國中藥雜志,2009,34(6):651-655.

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[6] 包立軍.桑椹中原花青素超聲波提取工藝研究[J].安康學院學報, 2012,24(6):81-84.

[7] 左勇,李楊,謝暉,等.桑椹果酒酒糟中原花青素提取工藝研究[J]. 中國釀造,2012,31(8):40-44.

[8] 婁彬,張楠,游江舟,等.響應面法優化石榴皮中原花青素提取工藝[J].湖北農業科學,2012,51(17):3816-3820.

[9] 徐向宏,何明珠.試驗設計與Design Expert、SPSS應用[M].北京:科學出版社,2010：154-168.

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(責任編輯：張凱兵)

OptimizationofExtractionProcessofProcyanidinfromMulberrybyResponseSurfaceMethodology

Yuan Ling，Li Jianhua

(HubeiKeyLaboratoryofQualityControlofCharacteristicFruitsandVegetables,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China)

Using extraction rate as an indicator, the central composite design model was used to design an ultrasonic extraction technology of procyanidins from mulberry. Result showed that the cubic mathematical model was the optimal one and the optimum extraction parameters were as the following：ultrasonic power 315 W, liquid solid ration 60:1 (mL/g), extraction time 12 min, and the predicted extraction rate of procyanidins was 496.29 μg/g on the same conditions. It was verified that the processing parameters in this experiment were accurate and could be applied in the mass extraction of procyanidins from mulberry.

mulberry; procyanidins; response surface analysis; ultrasonic wave; extraction technology

TS202.3

A

2095-4824(2013)06-0060-04

2013-08-30

生物質廢棄物轉化利用湖北省協同創新中心(SWZ010)

袁 玲(1970- )，女，湖北孝感人，湖北工程學院生命科學技術學院副教授。

李建華(1969- )，男，湖北孝感人，湖北工程學院生命科學技術學院教授，理學博士。