不同類型土壤中分枝桿菌噬菌體分離率的比較

徐鳳宇，蘇勝兵，馬紅霞，高云航，么乃全，康元環，劉洪巖，周 鵬，陸承平，劉永杰,*

(1. 吉林農業大學動物科技學院，長春 130118；2.吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春 130118；3. 南京農業大學動物醫學院，南京 210095)

不同類型土壤中分枝桿菌噬菌體分離率的比較

徐鳳宇1,2,3，蘇勝兵1,2，馬紅霞1,2，高云航1,2，么乃全1,2，康元環1,2，劉洪巖1，周 鵬1，陸承平3，劉永杰3,*

(1. 吉林農業大學動物科技學院，長春 130118；2.吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春 130118；3. 南京農業大學動物醫學院，南京 210095)

為了解分枝桿菌噬菌體在自然界的生存環境，深入研究噬菌體在微生態環境中的作用奠定基礎。以含檸檬酸和磷酸氫二鈉的溶液為提取劑，從50份不同性質土壤中分離、純化分枝桿菌噬菌體，電鏡觀察初步確定其分類；統計分析土壤類型、酸堿度、含水量、陽離子交換量、有機碳含量對噬菌體分離率的影響。共分離純化到13株尾病毒目肌尾病毒科的分枝桿菌噬菌體。3種類型土壤的分枝桿菌噬菌體分離率分別為暗棕壤(41.2%)>黃棕壤(25.0%)>褐土(16.7%)；土壤pH值、含水量、陽離子交換量對分離率影響呈規律性：pH值和含水量分別在7.45—7.95和13.7%—21.7%時分離率最高;當陽離子交換量為20.8—28.6 cmol/kg時，分離率隨之升高而升高；未見有機碳含量對分離率的影響有明顯規律。

分枝桿菌噬菌體；土壤；分離率

噬菌體(bacteriophage)是寄生于細菌、支原體、螺旋體、放線菌等微生物中的一類病毒，亦稱細菌病毒，在自然界分布極廣，凡有上述微生物的地方，都有相應噬菌體存在。土壤中含恥垢分枝桿菌，推測土壤中也有恥垢分枝桿菌噬菌體。

恥垢分枝桿菌與結核分枝桿菌相比，生長速度快，只需48 h即進入穩定期[1]，而且二者細胞壁結構相似，用恥垢分枝桿菌為模式菌代替結核分枝桿菌等致病性分枝桿菌用于科學研究，既安全又方便，但至今國內分離分枝桿菌噬菌體的報道也很罕見。

病毒于土壤中通常以吸附態和游離態兩種形式存在，它們可相互轉化，并在轉化過程中可引起病毒衰減，故遷移和解吸附兩種行為是影響土壤中病毒數量的主要因素。鑒于土壤類型、pH值、含水量、有機碳、陽離子交換量(CEC)是影響上述兩種行為的主要因素，為研究各因素對土壤中噬菌體存在的影響規律，本研究從不同類型土壤中分離恥垢分枝桿菌噬菌體，并以噬菌體分離率為指標進行了具體分析，為研究分枝桿菌噬菌體在土壤中的生存環境及從中分離其他微生物提供參考，也希望能為土壤微生物學和土壤生態學的研究提供有價值的資料。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

50份不同類型供試土壤，分別采自吉林農業大學園藝花卉實習基地植物根部(1—20號)、山西省晉中市榆次區田間或野外植物根部(37—50號)、江蘇省南京市南京農業大學及下馬坊公園植物根部(21—36號)。所有土樣均采自距表層10—15 cm處。

1.2 試驗試劑

7H9液體培養基 按BD醫療器械有限公司提供的Middlebrook 7H9肉湯培養基制作方法配制；滅菌前向其中加入1.5%瓊脂粉為7H9固體培養基；向其中加入0.7%瓊脂粉為7H9半固體培養基。

噬菌體提取劑 稱C6H8O7(檸檬酸)和Na2HPO4溶于36 mL蒸餾水，使終濃度分別為5 mmol/L和0.05 mmol/L，高壓滅菌后室溫保存。

噬菌體保存液(SM液體) ①2%明膠：2 g明膠加蒸餾水100 mL，121 ℃滅菌20 min后室溫保存；②1 mol/L Tris-Cl(pH值7.5)：Tris 12.11 g加H2O 80 mL，用濃鹽酸調節pH值至7.5，再加蒸餾水定容至100 mL；③SM液：NaCl 2.9 g+MgSO4·7H2O 1.0 g+1 mol/L Tris-Cl(pH值7.5)25 mL+2%明膠2.5 mL，加H2O定容至500 mL，121 ℃滅菌20 min后室溫保存備用。

1.3 恥垢分枝桿菌培養

將實驗室保存的恥垢分枝桿菌(M.smegmatismc2155)劃線分離培養48 h，挑取單個菌落于7H9液體培養基中培養，48 h后取菌液接入7H9培養基中培養72 h，置4 ℃備用。

1.4 土壤理化性質測定方法

土壤pH值用pH計(PHS-3C計)測定；土壤含水量和陽離子交換量依次采用采用烘干法和乙酸銨法測定[2]；土壤有機碳含量采用重鉻酸鉀容量法(外加熱法)進行測定[3]。

1.5 噬菌體的分離

參照文獻[4]從土壤中分離噬菌體的方法進行。

取2 g土壤放入錐形瓶，加2 mL蒸餾水；恒溫4 ℃冰箱中孵育1 d，加入噬菌體提取劑36 mL(pH值為9.4)，室溫、250 r/min振蕩30 min，使提取劑與噬菌體充分接觸；9 000 r/min離心30 min；0.22 μm微孔濾膜過濾上清液并調節pH值至6.6；將9 mL濾液與10 mL 2倍濃縮7H9液體培養基及1 mL菌液混合，37 ℃ 150 r/min振蕩培養48 h；靜置10 min，調節pH值至9.4，4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，調節上清液pH值至7.3后微孔濾膜過濾，點滴法和雙層平板法分別檢測濾液中的噬菌體。

1.6 噬菌體的純化

制備雙層平板：取恥垢分枝桿菌72 h培養液0.5 mL與適當稀釋的噬菌體原液0.1 mL混勻，室溫放置15 min后加入冷卻至50 ℃的半固體培養基，混勻后立即倒入制備好的固體7H9培養基上，待瓊脂凝固后，37 ℃倒置培養36 h，觀察噬菌斑。

純化：用滅菌牙簽挑取形態大小一致、單個獨立的典型噬菌斑，置于盛有1 mL SM液的EP管中，室溫放置1 h后4 ℃過夜，次日經旋渦振蕩器振蕩數秒后取0.1 mL經適當稀釋，重復以上操作制備雙層平板純化。重復此步驟3—5次，當每次觀察到的噬菌斑大小和形態均勻一致時，即得到純化的噬菌體。

1.7 噬菌體的電鏡觀察

取適當稀釋的噬菌體，經雙層平板培養形成噬菌斑網絡后，加入SM液，4 ℃振蕩過夜，洗下噬菌體，11 000 r/min離心30 min，取上清液過濾，用2%磷鎢酸染色1.5 min，透射電鏡觀察噬菌體形態、大小。

1.8 計算分離率

分離率=噬菌體分離陽性的土壤樣本數/樣本容量×100%

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質測定

經測定，所采集的50份土壤樣本的類型、部分理化性質結果如表1。

2.2 噬菌體分離

采用點滴法和雙層平板法(圖1)分別檢測噬菌體，檢測結果顯示：用點滴法檢測時，有時會出現直徑稍小的透明圈的假陽性現象，但用雙層平板檢測為陰性。說明雙層平板法的檢測效果好于點滴法。因此本研究以雙層平板法檢測結果為準，顯示暗棕壤組有7個樣本分離呈陽性，分別是2、4、6、7、12、15、17號樣本；黃棕壤組有4個樣本為分離陽性，分別是22、24、26、31號樣本；褐土組有2個樣本為分離陽性，分別是48、50號樣本，棕壤和黑壚土兩組中無陽性樣本。

2.3 噬菌體純化

采用雙層平板法反復純化5次得到13株噬菌體，并將它們分別命名為：CJAUS 6—18。

2.4 噬菌體的電鏡觀察

在透射電鏡下觀察噬菌體的形態，所有分離株均為肌尾噬菌體，但大小略有差異(表2)。CJAUS12的形態、大小見圖2。

表1 供試土壤的類型及理化性質

表2 電鏡下噬菌體的大小

圖1 雙層平板法檢測CJAUS10的結果Fig.1 Plaque of CJAUTES10 detected by using double-floor method

圖2 電鏡下的CJAUS12噬菌體Fig.2 Morphology of phage CJAUS12

2.5 分離率的計算及比較

2.5.1 不同類型土壤分離率

暗棕壤組的分離率=7/17×100%=41.2%

黃棕壤組的分離率=4/16×100%=25.0%

褐土組的分離率=2/12×100%=16.7%

由本試驗結果可知，暗棕壤組的分離率最高，褐土組的分離率最低，推測分枝桿菌噬菌體在暗棕壤中存活率最高。

2.5.2 分離率與土壤理化性質的關系分析

由表1中可知50份土壤樣本的pH值，最低為3.45，最高為10.2。分離陽性樣本主要集中在5.95—8.95之間，由于5.95—6.45組中只有一個樣本，其分離率偶然性較高，故只對其他5組的分離率與土壤pH值的關系進行分析。結果如圖3,pH 7.45—7.95組的分離率最高(60%)，低于此區間時，分離率隨pH值的升高而升高，相反，高于此區間時隨pH值的升高而降低。

圖3 分離率與土壤pH值、含水量的關系Fig.3 The relationship between pH/moisture content of soil and isolating rate

測定所有土壤樣本的含水量，最低為10.7%，最高為21.6%；陽性樣本主要集中于13.7%—21.7%間；對分離率分析結果顯示：18.7%—19.7%組的分離率最高(66.7%)，并以此為峰值，峰前隨含水量的升高而升高，峰后隨含水量的升高而降低(圖3)。

所有供試土壤樣本的有機碳含量最低為11.3 g/kg，最高為104.8 g/kg(圖4)所示；分離陽性樣本主要集中在21.3 g/kg—61.3 g/kg之間，噬菌體分離率隨有機碳的變化規律不明顯；如果排除偶然的因素(即去掉樣本總數較少的組：51.3 g/kg—56.3 g/kg和56.3 g/kg—61.3 g/kg，則分離率隨有機碳含量的升高有依次遞增的趨勢。

所測樣本的最低CEC為18.2 cmol/kg，最高為31.8 cmol/kg；分離陽性樣本主要集中在20.8—28.6 cmol/kg之間，在此區間內，分離率隨CEC的升高而呈逐漸上升的趨勢(圖4)。

圖4 分離率與有機碳、土壤CEC的關系Fig.4 The relationship between organic matter/CEC of soil and isolating rate

3 討論

不考慮分離方法對分離率的影響[4]，土壤中含分枝桿菌活噬菌體是成功分離的前提條件，且其中活噬菌體數量決定著分離率高低。本研究從中國境內3個省份隨機取50個土壤樣本，經土壤類型鑒定和噬菌體分離試驗發現暗棕壤組的分離率較黃棕壤組和褐土組高，這可能與以下3方面因素有關：①與黃棕壤和褐土相比，暗棕壤的有機碳含量相對較高，從而減少了微生物之間的代謝競爭[5]，有利于噬菌體的增殖；②由于氣候不同，淋溶和風化作用對褐土和黃棕壤表層微生物的生存環境影響較大，進而影響表層活噬菌體的數量，從而影響噬菌體的分離率，而暗棕壤則較少受到這種影響；③本研究的暗棕壤來源于花卉實習基地，環境小氣候也在一定程度上影響了分離率。

對分離率隨土壤pH值的變化規律分析后可知：pH值在6.45—8.95時，隨pH值的增大，噬菌體分離率先升高后降低，并于7.45—7.95之間最大，可能是該類噬菌體的pI值位于7.45—7.95之間的緣故，當環境pH值

微生物密度和活性往往在高度充滿降水和水流的地表和地下環境中較高，而且分化后的地表礦石組分和有機質的豐富程度可以通過微生物的更高和更一致的數量和行為分布得到反映[5]。因此土壤含水量和有機碳含量對土壤中噬菌體的生存也有影響。圖3顯示：含水量為18.7%—19.7%時分離率最高(66.7%)，這可能是因為長時間含水量超過19.7%時，宿主菌所需營養成分逐漸向地下遷移或流失，限制了宿主菌活動，而含水量低的土壤又因不能滿足微生物代謝活動時對水分的需要，影響噬菌體的分離。雖有資料顯示，含水量在40%以內，細菌總量隨含水量的降低而降低[8]，但筆者認為土壤含水量對細菌的影響因細菌的種類而異。另外，一定范圍內，含水量高的土壤還可降低病毒進入氣-水界面的機會，從而降低病毒的死亡率[9- 10]，進而保護噬菌體的活力和數量，有利于病毒的分離，筆者認為這可能是含水量<18.7%時分離率隨含水量升高而提高的原因所在。理論上土壤有機碳為宿主菌提供了所需碳源，可增加分枝桿菌噬菌體的數量，且高有機碳含量會增強病毒與土壤顆粒的解吸[11]，因此，選用有機碳含量高的土壤可提高噬菌體的分離率。雖然本研究對分離率水平和有機碳含量的關系分析表明分離率隨有機碳增加(減少)并無明顯變化規律(圖4)，有悖于前述規律，但有資料表明有機碳含量對病毒吸附的影響并不一致[12- 14]，需綜合考慮土壤類型、病毒類型、有機質特性[15]，故此結果可能是土壤類型及其理化性質等綜合因素造成的。

CEC主要通過改變土壤溶液的濃度和陰、陽離子組成兩個途徑影響土壤對噬菌體的吸附[16]。二者與土壤對病毒的吸附都成正比例關系，也可以說從CEC含量高的土壤中分離到分枝桿菌噬菌體的概率相對較高，但這只局限于某一范圍內。如圖4所示：本研究中陽性樣本只出現在20.8—28.6cmol/kg之間，在此范圍內，分離率隨CEC的升高而升高。

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Comparisonofisolationrateofmycobacteriophageinthedifferenttypesoils

XU Fengyu1,2,3,SU Shengbing1,2, MA Hongxia1,2, GAO Yunhang1,2, YAO Naiquan1,2, KANG Yuanhuan1,2, LIU Hongyan1, ZHOU Peng1, LU Chengping3, LIU Yongjie3，*

1CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China2KeyLaboratoryofAnimalProduction,ProductQualityandSecurity,MinistryofEducationofthePeople′sRepublicofChina,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China3CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

Phages are abundant and ubiquitous in nature, and are therefore important components of microbial communities. The investigation on the survival environment of bacteriophage in the nature might lay a foundation for the further study on regulating function of phage in the microecological environment. To understand the ecology of mycobacteriophage, we collected different types of soil samples from three areas in China to determine the isolation rates of phages and analyzed the relationship between isolation rates and four affecting factors in this study. The mycobacteriophages were isolated from 50 soil samples with mixed lyosol of citric acid and disodium hydrogen phosphate dodecahydrate as extractant. The isolation result was detected by the double agar method and dipping method. At the same time, pH value, moisture, organic carbon level and cation exchange capacity of samples were measured. Thirteen strains of mycobacteriophages were isolated and named from CJAUS6 to CJAUS18. The morphological observation under the transmission electron microscope showed that, all the isolates have a regular icosohedron head [(86.5±5.83—108±23.2)nm ×(83.2±3.04—93.2±5.92)nm ] and a contract tail [(73.0±8.36—87.7±1.86)nm ×(19.3±1.44—30.7±8.78)nm]. So they can be classified as a member of the orderCaudoviralesand the familyMyoviridae. The isolation results from five types of soils indicated that the isolation rate (41.2%) from dark brown earth was highest, followed by yellow brown earth (25.0%) and drab soil (16.7%), while no phages were isolated from the heilu soil and brown earth samples. The reason might relate to three factors as follows: firstly, the organic carbon level is the most in the dark brown earth; secondly, the influence of weathering and eluviatin on dark brown soil is weaker than that on yellow brown earth and drab soil; thirdly, the dark brown earth in this paper was affected by microclimate. In order to know the relationship between the isolation rate and affecting factors, the two-dimentional coordinates graphs were drawn by means of Microsoft Office Excel Software. The result showed that the isolation rate was the highest when the pH value was between 7.45 and 7.95, and moisture was between 13.7% and 21.7%, and the curve of their relationship was expressed as a same inverted "V" form. When the cation exchange capacity was between 20.8cmol/kg and 28.6cmol/kg, the isolation rate had a positive proportion with cation exchange capacity. It is supposed that the way in which cation exchange capacity affects isolation rate might attribute to the change of concentration and composition of anions and cations in the soil solution. And we found the concentration and composition of anions and cations is proportional to the adsorption quantity of phages. There was no obvious correlation between the isolating rate and organic carbon capacity. The results indicated that the soils types and physical and chemical properties of soils might contribute to the isolation rates of mycobacteriophage. Further work will be performed on the relationships between bacteriophage pI and soil pH values, and between water content in soil and the titres of host bacteria.

mycobacteriophage; soil; isolation rate

2012- 04- 28;

2012- 09- 11

*通訊作者Corresponding author.E-mail:

10.5846/stxb201204280612

徐鳳宇，蘇勝兵，馬紅霞，高云航，么乃全，康元環，劉洪巖，周鵬，陸承平，劉永杰.不同類型土壤中分枝桿菌噬菌體分離率的比較.生態學報,2013,33(15):4616- 4622.

Xu F Y,Su S B, Ma H X, Gao Y H, Yao N Q, Kang Y H, Liu H Y, Zhou P, Lu C P, Liu Y J.Comparison of isolation rate of mycobacteriophage in the different type soils.Acta Ecologica Sinica,2013,33(15):4616- 4622.