拉米夫定聯合α干擾素序貫處理增強干擾素誘導跨膜蛋白表達的研究

楊 凱，管世鶴，王愛華，潘 穎，吳園園，孫蓓蓓

乙型肝炎是危害人類健康的重要疾病之一，且隨著時間進程可能會發展為慢性乙肝、肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌［1］。IFN-α和拉米夫定是臨床上兩種重要的抗HBV藥物。其中，IFN-α是一種細胞因子，能夠通過誘導宿主細胞表達抗病毒蛋白:如雙鏈RNA激活的蛋白激酶(PKR)、2'，5'-寡腺苷酸合成酶(2'，5'-OAS)、抗粘液病毒 A蛋白(MxA)、抗粘液病毒B蛋白(MxB)，進而發揮抗HBV活性;抗病毒核苷類似物拉米夫定主要抑制HBV多聚酶的逆轉錄酶活性，從而有效阻止病毒核酸的復制合成［2－3］。有學者研究報道顯示，拉米夫定聯合IFN-α序貫治療慢性乙型肝炎療效明顯優越于IFN-α單獨治療［4］。此外，本課題組前期研究也發現，在體外實驗中拉米夫定聯合 IFN-α序貫處理HepG2.2.15細胞后，細胞內的HBV復制明顯減少，而IFN-α單獨處理對HepG2.2.15細胞內HBV復制沒有明顯影響，但相關的分子生物學機制尚未闡明［5］。為此，本實驗通過分析比較IFN-α單獨處理和拉米夫定聯合IFN-α序貫處理對人肝胚瘤細胞株HepG2.2.15表達干擾素誘導跨膜蛋白(IFITM1、IFITM2、IFITM3)的影響，研究拉米夫定與IFN-α序貫處理的抗HBV機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 轉染試劑盒脂質體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。IFN-α1b購自深圳科興生物工程有限公司。抗 IFITM1、IFITM2、IFITM3購自Santa Cruz公司。二抗購自中杉金橋公司。質粒pEGFP-N1購自 Invitrogen公司。質粒 pEGFP-IFITM1和HepG2.2.15細胞由本實驗室保存。

1.2 質粒的提取及酶切鑒定 分別搖含有質粒pEGFP-N1、pEGFP-IFITM1 菌液各 300 ml，采用 Pure YieldTMplasmid Midiprep System試劑盒，提取過程按照試劑盒說明書進行，質粒 pEGFP-IFITM1采用EcoR I、BamHⅠ雙酶切鑒定。

1.3 細胞的培養及分組處理 HepG2.2.15細胞以DMEM 培養，并補充2 mmol·L－1谷氨酰胺、50 kU·L－1青霉素、50 mg·L－1鏈霉素、500 mg·L－1G418、5%(vol/vol)FCS，于 5%CO2條件下 37℃孵育箱培養。HepG2.2.15細胞復蘇后用含10%小牛血清、100 kU·L－1青霉素、100 kU·L－1鏈霉素、2 mmol·L－1谷氨酰胺DMEM培養液培養。待細胞生長到約40% ～50%融合時，以0～1 000 kU·L－1IFN-α連續處理 HepG2.2.15細胞為 IFN-α 單獨處理組，以20 μmol·L－1拉米夫定聯合0 ～1 000 kU·L－1IFN-α 處理的 HepG2.2.15 細胞為序貫處理組。轉染前1 d行HepG2.2.15 細胞傳代，并以5 ×107·L－1接種6孔板。接種后d 2待細胞匯合約為75%時按試劑盒說明書步驟分別將質粒pEGFP-N1和pEGFP-IFITM1 與 LipofectamineTM2000 250 μl混勻至無血清DMEM行轉染，其中HepG2.2.15細胞不做任何處理為未轉染組，HepG2.2.15細胞按上述轉染方法轉染質粒pEGFP-N1為空載體組，HepG2.2.15細胞轉染表達IFITM1蛋白的質粒 pEGFP-IFITM1為轉染組。

1.4 免疫印跡技術分析 6孔板中細胞用預冷PBS洗3次，每孔加80 μl含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上反應 10 min，振蕩，12 000 r·min－1，4℃離心10 min，收集上清液與20 μl蛋白上樣緩沖液混合煮沸10 min。取20 μl行SDS-PAGE電泳，80 mA電流2 h濕電轉，10%脫脂奶粉封閉過夜，加一抗過夜，PBS洗3次;加二抗室溫孵育2 h，PBS漂洗3次，ECL試劑盒檢測。

1.5 Southern blot技術分析 收集處理的HepG2.2.15 細胞，用裂解液Ⅱ (50 mmol·L－1Tris-Cl，pH 7.4，150 mmol·L－1NaCl，5 mmol·L－1MgCl2，0.5%NP-40)室溫裂解 5 ～10 min;離心，分離胞漿制備物并以DNA酶(DNase I，Roche，Germany)消化未受保護的DNA。用 SDS、NaCl和蛋白酶K(proteinase K，QIAGEN)進行序列處理，再用酚/氯仿(1∶1，vol/vol)、氯仿抽提懸浮液，異丙醇沉淀HBV復制中間體DNA(RI)。將20 μg含HBV復制中間體DNA的胞漿制備物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，轉移到Hybond-N+陽離子尼龍膜上，經干燥、變性、中和后與32P標記的HBV DNA探針雜交。1.6 ELISA分析細胞外HBV抗原 分別收集不同濃度和不同處理時期的培養上清液，按1 200 r·min－1離心10 min以去除細胞碎片，于－20℃保存上清。將收集的條件上清液用ELISA法按試劑盒說明書檢測HBsAg和HBeAg，讀取450 nm波長吸光度值并計算出HBsAg和HBeAg量。

2 結果

2.1 IFN-α單獨處理 HepG2.2.15 細胞后干擾素誘導跨膜蛋白的表達 免疫印跡技術分析發現，IFN-α連續處理 HepG2.2.15 細胞 12 h 后，隨著IFN-α濃度的上升，干擾素誘導跨膜蛋白IFITM1在HepG2.2.15細胞的表達逐漸上升，表達量分別為0.28±0.08、0.44±0.10、1.16±0.21;IFITM2表達量為 0.56±0.11、0.71±0.07、1.56±0.20;IFITM3表達量為0.14±0.06、0.22±0.08、0.35±0.11。見Fig 1。

Fig 1 Expression of IFITM1，IFITM2 and IFITM3 proteinin HepG2.2.15 cells treated with different concentrations of IFN-α

2.2 拉米夫定聯合 IFN-α序貫處理 HepG2.2.15細胞后抗病毒蛋白的表達 免疫印跡技術分析提示20 μmol·L－1拉米夫定處理 HepG2.2.15 細胞 7 d，再分別補充 0、500、1 000 kU·L－1IFN-α 序貫處理細胞后，IFITM2表達量為0.31±0.20、0.69±0.12、1.61±0.23，IFITM3表達量為0.15±0.09、0.21±0.10、0.37±0.13，IFITM2和 IFITM3 無變化，而 IFITM1表達量為 0.46±0.09、0.75±0.08、2.07±0.22，在HepG2.2.15細胞的表達增高。見 Fig 2。

Fig 2 Expression of IFITM1，IFITM2 and IFITM3 protein in HepG2.2.15 cells treated with 20 μmol·L －1lamivudine and different concentrations of IFN-α

2.3 IFN-α單獨處理和拉米夫定聯合IFN-α序貫處理對 HepG2.2.15細胞內 HBV復制的影響

Southern blot分析提示，分別采用單獨IFN-α和拉米夫定聯合 IFN-α序貫處理HepG2.2.15細胞時，單獨IFN-α對細胞內HBV DNA無明顯影響;1 000 kU·L－1IFN-α與拉米夫定聯合處理3 d后，細胞內的HBV DNA完全消失。見Fig 3。

2.4 抗病毒蛋白 IFITM1對 HepG2.2.15細胞內HBV的影響 抗病毒蛋白IFITM1轉染HepG2.2.15細胞24～72 h后，細胞上清液中HBsAg的S/CO值為0.31±0.15、1.18±0.27和1.62±0.12，其中轉染48 h與72 h細胞上清液中HBsAg的S/CO值明顯高于轉染24h，P均＜0.05;HBeAg的S/CO值為1.91±0.20、1.78±0.23和2.35±0.21。IFITM1轉染組HBV抗原的S/CO值與空白對照組細胞上清液中HBsAg的S/CO值(0.33±0.12、1.79±0.14、

Fig 3 Effect of IFN-α or sequentially treated with lamivudine and IFN-α on the extracellular HBV DNA in HepG2.2.15 cells

3.05±0.24)和 HBeAg的 S/CO值(1.82±0.27、2.42±0.39、4.01±0.17)相比較，轉染48、72 h后，兩組細胞上清液中HBV抗原的S/CO值差異有統計學意義，P均＜0.05。但IFITM1蛋白對HepG2.2.15細胞內HBV DNA無影響，直至72 h。見 Tab 1、2。

Tab 1 Effect of IFITM1 on the extracellular HBsAg in HepG2.2.15 cells(ˉ±s，n=8)

Tab 1 Effect of IFITM1 on the extracellular HBsAg in HepG2.2.15 cells(ˉ±s，n=8)

*P ＜0.05 vs untransfected group and empty vector group

Group The S/CO ratio of HBsAg 24 h 48 h 72 h Untransfected 0.33 ±0.12 1.79 ±0.14 3.05 ±0.24 Empty vector 0.29 ± .014 1.72 ±0.11 3.11 ±0.20 Transfection 0.31 ±0.15 1.18 ±0.27* 1.62 ±0.12*

Tab 2 Effect of IFITM1 on the extracellular HBeAg in HepG2.2.15 cells(ˉ±s，n=8)

Tab 2 Effect of IFITM1 on the extracellular HBeAg in HepG2.2.15 cells(ˉ±s，n=8)

*P＜0.05 vs untransfected group and empty vector group

Group The S/CO ratio of HBeAg 24 h 48 h 72 h Untransfected 1.82 ±0.27 2.42 ±0.39 4.01 ±0.17 Empty vector 1.76 ±0.32 2.51 ±0.33 4.2 ±0.12 Transfection 1.91 ±0.20 1.78 ±0.23* 2.35 ±0.21*

3 討論

抗病毒治療是臨床上慢性乙型肝炎治療的關鍵，通過清除或持續抑制HBV復制，從而降低HBV致病性和減輕肝臟炎癥反應［6］。目前，公認有效的抗HBV藥物主要有IFN-α和核苷酸類似物拉米夫定，兩種藥物具有不同的抗HBV機制。IFN-α通過激活細胞JAK-STAT信號轉導途徑編碼合成諸多抗病毒蛋白表達，抑制病毒復制，而拉米夫定發揮抗HBV作用的靶位點是HBV逆轉錄酶。臨床研究表明，慢性乙型肝炎患者單獨IFN-α抗病毒治療的完全應答率不高，然而，經拉米夫定聯合IFN-α序貫治療后能夠明顯提高IFN-α抗HBV療效。在體外實驗中，拉米夫定聯合 IFN-α序貫處理能夠抑制HepG2.2.15細胞內的 HBV 復制，而單獨 IFN-α 對HepG2.2.15細胞內HBV復制沒有明顯影響。據此，我們推測拉米夫定聯合IFN-α可能通過影響IFN-α抗病毒蛋白的表達而提高IFN-α抗病毒療效。

本研究發現，HepG2.2.15細胞分別經 IFN-α單獨處理和拉米夫定聯合IFN-α序貫處理后，細胞內干擾素誘導跨膜蛋白(IFITM1、IFITM2、IFITM3)的表達和病毒復制具有一定差異。其中，干擾素誘導跨膜蛋白IFITM1隨著IFN-α濃度的增加，在序貫處理組HepG2.2.15細胞中的表達逐漸增高，同時細胞內HBV復制明顯減少。然而，在IFN-α單獨處理組并未出現IFITM1的表達隨著IFN-α濃度的增加而增加和病毒復制減少，這表明拉米夫定聯合IFN-α序貫處理可能通過上調IFITM1的表達進而抑制HBV復制。通過基因轉染我們還發現，IFITM1在HepG2.2.15中能夠抑制HBV蛋白的表達，表現出一定抗HBV活性，這也進一步證實拉米夫定聯合IFN-α序貫治療能夠提高IFN-α抗HBV活性。

總之，本研究初步探討了拉米夫定聯合IFN-α序貫治療抗HBV機制，并認為拉米夫定聯合IFN-α序貫處理增強IFN-α誘導HepG2.2.15表達干擾素誘導跨膜蛋白IFITM1，這可能是臨床上拉米夫定聯合IFN-α序貫治療慢性乙型肝炎重要機制之一，并為提高IFN-α抗病毒療效提供新策略。

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