魷魚墨多糖對環磷酰胺誘導的小鼠腸道黏膜損傷的保護作用及初步機制研究

曹 露，左 濤，李學敏，于 卿，曹斌斌，王靜鳳，王玉明，薛長湖，唐慶娟

化療是目前世界上公認的腫瘤三大治療方法之一，由化療引起的消化道不良反應給患者造成了極大的痛苦［1］。環磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)是目前臨床上常用的化療藥物，作用機制是能夠殺傷增殖迅速的組織細胞。但是，環磷酰胺在殺傷腫瘤細胞的同時也會殺傷正常組織的細胞，特別是人體中生長旺盛的胃腸組織細胞，因而導致各種胃腸道不良反應，如惡心、嘔吐、腹瀉等［2］。據報道，全世界每年有50萬患者受此癥干擾。尋找能夠預防化療藥物胃腸道不良反應的生物活性物質，對于提高腫瘤患者的生活質量、保證化療效果具有重要意義。

魷魚墨是豐富易得的海洋生物資源。研究證實，魷魚墨主要由黑色素和富含巖藻糖的黏多糖組成［3］。大量的研究表明，魷魚墨汁具有止血［4］、抗凝血［5］、抗菌［6］、抗輻射［7］、抗氧化［8－9］、升高白細胞［10］等多種生理活性，是一種極具潛力的天然藥物資源。北太平洋魷魚(Ommastrephes bartrami)，屬真魷科，赤魷屬。其個體墨囊相對較大，是目前世界上主要捕撈和加工的魷魚品種。本課題組分離純化了北太平洋魷魚墨多糖，對其化學結構及抗凝血活性進行了研究;并且，在環磷酰胺腹腔注射構建化療小鼠模型基礎上，證實該多糖具有提高化療小鼠腸道SIgA分泌的作用，提示其具有保護腸道黏膜的作用(論文另發表)。

本文擬深入研究北太平洋魷魚墨多糖對化療小鼠腸道黏膜損傷的保護作用，并對其作用機制進行初步探討，旨在為開發以魷魚墨多糖為功效因子的輔助化療保健食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑、動物 注射用環磷酰胺(批號:12042725)為江蘇恒瑞醫藥股份有限公司產品。北太平洋魷魚墨多糖為中國海洋大學食品科學與人類健康實驗室制取。Balb/c近交系小鼠，♂，7－8周齡，體質量(20±2)g，SPF級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司［動物合格證編號:SCXK(京)2012-000］。BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)購于碧云天生物技術研究所。超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(A001-3)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(A003-1)購于南京建成生物工程研究所。

1.2 動物實驗 Balb/c小鼠于動物房適應飼養1周后，按照體重隨機分為5組，每組10只，即正常組、環磷酰胺模型組、魷魚墨多糖低劑量組50 μg·g－1bw、中劑量組 100 μg·g－1bw、高劑量組 200 μg·g－1bw。正常組、模型組經口灌胃生理鹽水作為對照，各劑量組經口灌胃相應濃度的魷魚墨多糖，1次/天，連續 28 d。d 26，27，按 50 μg·g－1bw 的劑量腹腔注射環磷酰胺建立化療小鼠模型，正常組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水作為對照。d 29將小鼠摘眼球處死，取小腸組織備用。

1.3 形態學觀察 取小腸空腸段約3～4 cm置于10%中性甲醛中固定，常規石蠟包埋后制作石蠟切片，并進行HE染色，光鏡下觀察并拍照記錄。每組取5只小鼠的切片，每只小鼠取3個不同視野，每個視野隨機選擇5個完整的絨毛－隱窩單位進行測量小腸絨毛高度(以腸腺絨毛連接處到絨毛頂端為準)、隱窩深度(以腸腺絨毛連接處到腸腺基部為準)，并計算絨毛高度與隱窩深度的比值(V/C比值)。

1.4 差異蛋白分析 取小腸回腸段約3 cm，加入RIPA裂解液勻漿。經BCA法進行蛋白濃度測定后，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，考馬斯亮藍染色。顯影結果經凝膠成像系統(GIS-2008型，上海天能)灰度掃描、拍照。取特異性高表達的蛋白條帶，委托上海生工生物工程技術服務有限公司完成質譜鑒定。主要內容包括:脫色，酶解，ABI 4800串聯質譜(Maldi-Tof-Tof/MS)分析，氨基酸序列比對后獲得特異性蛋白質的詳細信息。

1.5 小腸勻漿上清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的測定 小腸組織勻漿后取上清，按照試劑盒說明書進行。采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活力，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。

2 結果

2.1 魷魚墨多糖對小鼠飲食、腹瀉狀況和體重的影響 正常組小鼠的進食量與飲水量均無明顯變化，無腹瀉現象發生;其余各組小鼠在注射環磷酰胺后均出現體重減輕的現象，其中，高劑量組下降的幅度最小，中劑量組下降的幅度最大，模型組次之(Fig 1)。此外，各組小鼠的進食量及飲水量也有所減少，其中部分小鼠出現腹瀉現象，糞便呈稀黃狀;注射環磷酰胺后d 3腹瀉現象加重，小鼠活動量減少，尤以模型組表現最為嚴重。

2.2 魷魚墨多糖對小腸絨毛高度、隱窩深度及V/C值的影響 模型組小鼠小腸絨毛長度低于正常組小鼠，且差異有顯著性(P＜0.01);與模型組相比，中劑量組和高劑量組絨毛長度增加(P＜0.01)，但低劑量組降低(P＜0.01)(Fig 2)。模型組小鼠小腸隱窩深度高于正常組小鼠，且差異有顯著性(P＜0.05);與模型組相比低、中、高劑量組隱窩深度降低(P＜0.01)(Fig 3)。模型組小鼠V/C值低于正常組，且有差異顯著性(P＜0.01);與模型組相比低、中、高劑量組V/C值升高(P＜0.01)(Fig 4)。

Fig 1 Change of mice body weight before and after building model

Fig 2 Effects of squid ink polysaccharide onvillus length of mice(ˉ ± s，n=5)

Fig 5 SDS-PAGE result of intestinal tissue

Fig 6 Mass spectrometry identification results

2.3 SDS-PAGE分析小腸組織蛋白表達差異 為了探討魷魚墨多糖對化療小鼠消化道不良反應的預防作用機制，采用SDS-PAGE蛋白電泳方法，尋找小腸組織差異表達的蛋白質(Fig 5)。對差異表達的蛋白條帶A進一步脫色，酶解，進行Maldi-Tof-Tof/MS質譜分析。質譜鑒定結果顯示(Fig 6)，該蛋白為谷胱甘肽巰基轉移酶ω-1(glutathione S-transferases omega-1，GSTsω-1)(27 ku)。2.4 魷魚墨多糖對小腸組織勻漿上清中MDA與SOD含量的影響 為了探究魷魚墨多糖對小鼠腸道氧化應激損傷的改善作用，按照試劑盒操作步驟，檢測各組小鼠小腸勻漿上清液中MDA與SOD的含量(見Tab 1、2)。與正常組相比，模型組小鼠腸道MDA含量增高，而魷魚墨多糖組小鼠腸道MDA含量明顯下降，且低、中、高劑量組均有統計學意義(P＜0.05，P ＜0.05，P ＜0.01)。與正常組相比，模型組小鼠腸道SOD活力降低，魷魚墨多糖組小鼠腸道SOD活力明顯上升，其中高劑量組最明顯(P＜0.01)。

Tab 1 Effects of squid ink polysaccharide onMDA level in mice small intestine(n=10)

Tab 2 Effects of squid ink polysaccharide on SOD activityin mice small intestine(n=10)

3 討論

環磷酰胺是治療惡性腫瘤常用的化療藥物，具有廣譜抗癌作用，是聯合化療、手術和放療輔助化療的常用藥物之一［11］。環磷酰胺的毒副作用主要是免疫抑制［12］和胃腸道不良反應。本課題組研究表明，連續6 d給予正常小鼠腹腔注射50 mg·(kg·bw)－1的環磷酰胺后，小腸黏膜完整性遭到破壞，小腸絨毛變短且稀疏散置，腸道SIgA分泌量減少［13］。提示可以利用環磷酰胺構建腸黏膜損傷的動物模型。

小腸是機體營養物質吸收和轉運的主要部位，小腸絨毛高度的增加代表著小腸吸收營養物質的面積增大，因此，小腸絨毛的長短與小腸的消化吸收能力有密切關系［14］。小腸隱窩是絨毛根部上皮陷入固有層形成的管狀腺。隱窩深度主要反映了上皮細胞的生成率，上皮細胞不斷從隱窩基部向絨毛端部遷移、分化，形成具有吸收能力的絨毛細胞，以補充正?；蛞馔鈸p傷導致的脫落［15］。當腸道受到侵襲或應激反應時，腸絨毛就會受損變短，絨毛上皮細胞就會減少，隱窩細胞便不斷產生大量具有分泌功能的未成熟上皮細胞以補充絨毛細胞，表現為隱窩深度變深，這種細胞的過量增加會導致機體腹瀉的發生。絨毛高度/隱窩深度的比值(V/C值)則綜合反映小腸的功能狀態。比值下降，表示消化吸收功能下降，常伴隨腹瀉的發生。比值上升，腹瀉率下降［16］。本研究結果顯示:模型組小腸絨毛高度和V/C值明顯低于正常組，隱窩深度明顯高于正常組，說明環磷酰胺能夠造成小腸黏膜上皮細胞損傷，而前期攝入魷魚墨多糖可以提高小腸絨毛長度，保護小腸隱窩，減少腹瀉的發生，提示其對小腸黏膜損傷具有保護作用。

為了探究魷魚墨多糖對環磷酰胺所致小腸黏膜損傷的保護作用機制，本文進一步分析了各組之間差異性表達的蛋白質。Maldi-Tof-Tof/MS質譜鑒定結果顯示，魷魚墨多糖高劑量組谷胱甘肽巰基轉移酶ω-1(27 ku)表達量增加。谷胱甘肽巰基轉移酶(GSTs)是普遍存在于各種生物體內的Ⅱ相代謝酶，能夠水解、滅活化學致癌物代謝中親電子疏水化合物，促其排出體外，具有解毒功能［17－18］。GSTs ω-1是GST omega家族中的一員，其在高劑量組中的特異性高表達表明魷魚墨多糖可以促使GSTs ω-1的產生，推測其可能參與降低腸道氧化應激損傷的反應。進一步對小腸組織勻漿液中MDA含量和SOD活力進行檢測，結果證實魷魚墨多糖對腸道的氧化應激損傷具有改善作用。因此，魷魚墨多糖對環磷酰胺所致腸黏膜損傷的保護作用與它能夠改善腸道氧化應激損傷有關。

本研究在分析小腸組織差異表達蛋白質的過程中發現，與模型組相比，魷魚墨多糖高劑量組的蛋白條帶明顯增多，提示該組小鼠小腸組織一些蛋白質出現特異性表達增高，具體機制有待進一步研究。

本研究表明環磷酰胺能夠造成小鼠腸黏膜結構損傷，魷魚墨多糖前期攝入可以保護小腸絨毛、隱窩，維持腸黏膜屏障的完整性，上述作用與其提高小腸抗氧化應激能力有關。本文研究結果為開發以魷魚墨多糖為功效因子的輔助化療保健食品提供了一定的理論依據。

［1］ 李曉燕，王 瓊.腫瘤患者化療不良反應的防治及護理［J］.中國民康醫學，2010，22(2):180 －1.

［1］ Li X Y，Wang Q.Prevention and nursing of tumor chemotherapy in patients with adverse reactions［J］.Med J Chin People's Health，2010，22(2):180 －1.

［2］ 鄧震亭.環磷酰胺藥理與毒理研究現狀［J］.天津藥學，2009，21(4):42－4.

［2］ Deng Z T.Cyclophosphamide pharmacology and toxicology research status［J］.Tianjin Pharm，2009，21(4):42 － 4.

［3］ Chen S，Xu J，Xue C，et al.Sequence determination of a nonsulfated glycosaminoglycan-like polysaccharide from melanin-free ink of the squid Ommastrephes bartrami by negative-ion electrospray tandem mass spectrometry and NMR spectroscopy［J］.Glycoconjugate J，2008，25(5):481 －92.

［4］ 逄 龍，王靜鳳，雷 敏，等.烏賊墨制品促進小鼠造血功能的實驗研究［J］.營養學報，2007，29(1):87 －90.

［4］ Pang L，Wang J F，Lei M，et al.The experimental studies on the effects of sepia products on hematopoiesis in mice［J］.Acta Nutrimenta Sin，2007，29(1):87 －90.

［5］ 陳士國，李兆杰，王玉明，等.魷魚墨多糖的硫酸酯化及抗凝血活性［J］.高等學?；瘜W學報，2010，31(12):2407 －12.

［5］ Chen S G，LI Z J，Wang Y M，et al.Sulfation of a squid ink polysaccharide and its anticoagulant activities［J］.Chem J Chin Univ，2010，31(12):2407 －12.

［6］ 杜鐵平，周培根.烏賊墨抗菌活性的分離與研究［J］.現代食品科技，2005，21(1):69－71.

［6］ Du T P，Zhou P G.The antibacterial study of the extract from inksac of cuttlefish on bacteria［J］.Mod Food Sci Technol，2005，21(1):69－71.

［7］ 雷 敏，王靜鳳，李兆杰，等.烏賊墨制品60Coγ輻射損傷小鼠造血功能的影響［J］.食品科學，2007，28(2):293－7.

［7］ Lei M，Wang J F，Li Z J，et al.Effects of sepia product on hemapoiecsis promotion in 60Coγ irradiated mice［J］.Food Sci，2007，28(2):293－7.

［8］ 陳士國，薛長湖.魷魚墨黑色素的自由基清除活性研究［J］.中國海洋藥物，2007，26(1):24 －7.

［8］ Chen S G，Xue C H.Studies on the free radical scavenging activities of melanin from squid ink［J］.Chin J Marine Drugs，2007，26(1):24－7.

［9］ Guo X，Chen S G，Hu Y Q，et al.Preparation of water-soluble melanin from squid ink using ultrasound-assisted degradation and its anti-oxidant activity［J］.J Food Sci Technol，2013(2):1 － 9.

［10］ Zhong J P，Wang G，Shang J H，et al.Protective effects of squid ink extract towards hemopoietic injuries induced by cyclophosphamine［J］.Mar Drugs，2009，7(1):9 － 18.

［11］ Greten T F，Ormandy L A，Fikuart A，et al.Low-dose cyclophosphamide treatment impairs regulatory T cells and unmasks AFP-specific CD4+T-cell responses in patients with advanced HCC［J］.J Immunotherapy，2010，33(2):211 －8.

［12］王思蘆，汪開毓，趙 玲，等.雞樅菌多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響［J］.中國藥理學通報，2013，29(1):59 －63.

［12］ Wang S L，Wang K Y，Zhao L，et al.Immunoloregulation effect of polysaccharide from Termitomyces albuminosus(Berk.)Heim.on immunosuppressive mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(1):59－63.

［13］左 濤，律迎春，曹 露，等.冰島參對小鼠腸道黏膜SIgA分泌的影響［J］.食品工業科技，2012，(1):373 －5.

［13］ Zuo T，Lv Y C，Cao L，et al.Promotion effect of Cucumaria frondosa on the secretion of mice intestinal SIgA［J］.Sci Technol Food Industry，2012，(1):373 －5.

［14］劉秋東，張中文，劉鳳華，等.復方白頭翁膠囊對腹瀉犬小腸絨毛長度和隱窩深度的影響［J］.北京農學院學報，2011，26(3):38－40.

［14］ Liu Q D，Zhang Z W，Liu F H，et al.Effects of herbal medicine on villus height and crypt depth in small intestine of canine［J］.J Beijing Univ Agricult，2011，26(3):38 －40.

［15］王子旭，佘銳萍，陳 越，等.日糧鋅硒水平對肉雞小腸黏膜結構的影響［J］.中國獸醫科技，2003，33(7):18－21.

［15］ Wang Z X，She R P，Chen Y，et al.Effect of different levels of zinc and selenium in diet on the structure of mucosa epithelium in broiler small intestine ［J］.Chin J Veter Sci Technol，2003，33(7):18－21.

［16］ Deane A M，Summers M J，Zaknic A V，et al.Glucose absorption and small intestinal transit in critical illness［J］.Crit Care Med，2011，39(6):1282 －8.

［17］梁 冰，張愛華.谷胱甘肽硫轉移酶Omega家族的研究進展［J］.中國公共衛生，2006，22(12):1526 －7.

［17］ Liang B，Zhang A H.Glutathione s transferase Omega family research progress［J］.Chin J Public Health，2006，22(12):1526 －7.

［18］ Sheehan D，Meade G，Foley V M，Dowd C A.Structure，function and evolution of glutathione transferases:implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily［J］.Biochem J，2001，11(15):1 －16.