慢性嗎啡處理對大鼠交感神經節pCREB和CREB mRNA表達的影響

何 萍，陳家歡，黃曉亮，于洪波，莫 寧

(廣西醫科大學藥學院1.藥理學教研室2.中心實驗室，廣西南寧 530021)

阿片類依賴可造成明顯的自主神經系統特別是交感神經系統功能的改變或損害，阿片類依賴的戒斷癥狀中交感神經亢進癥狀亦為其重要表現之一［1］。交感神經節是聯系交感神經中樞和效應器的神經核團，阿片類依賴對交感神經節的影響的研究很少。本研究組以往研究結果發現，慢性嗎啡處理后，交感神經節——頸上神經節(SCG)的快興奮性突觸傳遞［2］及突觸界面結構［3］發生了適應性改變;環腺苷酸(cAMP)水平也存在適應性上調［4］。本研究在以劑量遞增法建立慢性嗎啡依賴及戒斷模型的基礎上，運用免疫組織化學方法和RT-PCR法分別檢測磷酸化的環腺苷酸反應元件結合蛋白(phosphorylated cAMP response element binding protein，pCREB)和 CREB mRNA在SCG中的表達，進一步研究慢性嗎啡處理后交感神經節適應性改變的受體后信號轉導機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級♂Wistar大鼠共40只，質量190 g～210 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK桂2003-0003。

1.2 主要藥品與試劑 鹽酸嗎啡注射液，批號:080306，沈陽第一制藥廠生產。鹽酸納洛酮，Aldrich公司產品。兔抗pCREB多克隆抗體，工作濃度1∶200，北京市首都醫科大學宣武醫院多肽室制備;S-P免疫組織化學染色試劑盒(即用型)及DAB顯色劑:北京中杉金橋生物技術有限公司產品。Trizol試劑，美國Invitrogen公司;cDNA逆轉錄試劑盒，立陶宛MBI公司;引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 儀器 日本OPATICAL公司OLYMPUS VANOX顯微鏡照相系統;德國leica公司 DMR+550型病理圖像分析儀;美國Thermo公司高性能PCR擴增儀;美國Bio-Rad公司Gel Doc2000型凝膠電泳成像分析系統。

2 方法

2.1 動物分組及處理 動物隨機分為4組(n=10):正常對照組、嗎啡急性給藥組、嗎啡依賴組和嗎啡戒斷組。各組處理如前文獻所述［4］，即嗎啡依賴組和嗎啡戒斷組大鼠連續皮下注射嗎啡5 d建立慢性嗎啡依賴大鼠模型，d 1～5每次劑量分別為10、20、30、40、50 mg·kg－1，每日 2 次;正常對照組和嗎啡急性給藥組大鼠皮下注射等體積生理鹽水共5 d。正常對照組、嗎啡急性給藥組和嗎啡依賴組大鼠分別在d 6晨注射生理鹽水、嗎啡20 mg·kg－1、嗎啡50 mg·kg－14 h后取材;嗎啡戒斷組大鼠在末次注射嗎啡50 mg·kg－14 h后，腹腔注射納洛酮4 mg·kg－1催促戒斷癥狀，并在注射納洛酮1 h后進行取材。取材時，腹腔注射戊巴比妥鈉60 mg·kg－1深度麻醉大鼠后，鏡下迅速摘取雙側 SCG，備用。

2.2 pCREB蛋白免疫組織化學檢測 采用S-P法，按說明進行操作。顯微鏡下選入細胞均為細胞核呈棕褐色、與本底相比為中等到高度染色的陽性細胞。計算整個SCG內的陽性免疫產物面積百分率反映蛋白表達水平。

陽性免疫產物面積百分率%=陽性免疫產物面積/SCG總測量面積×100%

2.3 CREB mRNA的RT-PCR法檢測 引物序列按文獻［5］，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列如下:GADPH sense primer 5’-TCA TTG ACC TCA ACT ACA TG-3’，antisense primer 5’-GCA GTG ATG GCA TGG ACT GT-3’(439 bp);CREB sense primer 5’-TCA GCC GGG TAC TAC CAT TC-3’，antisense primer 5’-TCT CTT GCT GCT TCC CTG TT-3’(252 bp)。PCR 循環參數為:94℃45 s，50℃ 45 s，72℃ 1 min，共 30 個循環。擴增產物瓊脂糖凝膠電泳，檢測各擴增帶的光密度值，以GADPH校正作相對定量分析，結果以兩者的光密度比值表示。

3 結果

3.1 SCG中pCREB蛋白含量變化 pCREB免疫活性陽性產物主要在細胞核，胞質相對淡染。以核陽性免疫產物面積百分率反映蛋白表達水平。結果顯示:與正常對照組相比，嗎啡急性給藥組大鼠SCG中pCREB蛋白含量明顯降低(P＜0.05);嗎啡依賴組大鼠SCG的pCREB蛋白含量回到正常對照組水平，并有增高趨勢(與正常對照組比較，P＞0.05;與嗎啡急性給藥組比較，P＜0.01);嗎啡戒斷組大鼠SCG中pCREB蛋白含量明顯高于正常對照組(P＜0.01)。結果見Tab 1和Fig 1。

Tab 1 Expression of pCREB and CREB mRNA in rat SCG(±s，n=10)

Tab 1 Expression of pCREB and CREB mRNA in rat SCG(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;△△P＜0.01 vs morphine acute group

Group pCREB positive area percentage/%CREB/GADPH mRNA ratio Control 1.58 ±0.41 0.65 ±0.18 Mor acute 0.91 ±0.25* 0.58 ±0.21 Mor dependent 1.92 ±0.55ΔΔ 0.72 ±0.26 Mor withdrawal 2.82 ±0.94＊＊ΔΔ0.61 ±0.19

3.2 SCG中 CREB mRNA表達變化 各組間CREB mRNA表達水平無差異(P＞0.05)。結果見Tab 1和 Fig 2。

Fig 1 Expression of pCREB in SCG(immunochemistry×400)

Fig 2 The expression of CREB mRNA in SCG

4 討論

反復應用阿片類藥物，機體啟動適應機制，神經元及突觸功能發生適應性改變，導致神經元及神經網絡功能發生長期改變，是機體形成藥物依賴和耐受的機制之一［6］。我們以往的研究結果發現［2－4］，嗎啡急性給藥能抑制交感神經節SCG的快興奮性突觸傳遞并降低SCG中cAMP含量;嗎啡慢性處理后交感神經節SCG的突觸傳遞、突觸界面結構及cAMP含量均發生了適應性改變，表現為嗎啡抑制快興奮性突觸傳遞的作用明顯減弱，突觸界面結構中突觸后致密物厚度(PSD)增厚、突觸間隙變窄，cAMP含量較嗎啡急性給藥組明顯增加;納洛酮處理卻可增加SCG快興奮性突觸傳遞并進一步提高cAMP含量。因此推測cAMP的適應性上調可能是嗎啡慢性處理后交感神經節突觸適應性改變的受體后信號轉導機制之一。

CREB是一種核蛋白，是刺激誘導轉錄因子的主要成員，CREB的活化必須由磷酸化介導，多種通路已被證實可磷酸化CREB，其中研究最為透徹的為cAMP-cAMP依賴蛋白激酶A(PKA)通路對CREB的磷酸化。CREB分子N端的激酶誘導結構域(kinase inducible domain，KID)區包含有許多種蛋白激酶對CREB分子進行磷酸化的部位，其中第133位的絲氨酸殘基(Ser-133)是PKA的磷酸化位點。阿片類藥物與其受體結合后，通過升高胞漿內cAMP水平激活PKA，使轉錄因子CREB的Ser133磷酸化而激活CREB，使其與DNA調控區的cAMP反應元件(CRE)相結合，激活靶基因的轉錄，誘發遲發而持久的基因表達，使短時程的生物學效應轉變為長時程的生物學效應，可造成神經電活動的持久的改變，并導致神經元胞體、突起或突觸結構發生結構上的改變，參與慢性應用嗎啡引起的神經元和突觸的可塑性和適應性改變［7］。阿片類藥物依賴的形成過程中，伴隨細胞內cAMP信號轉導過程的變化，藍斑區域也相應發生CREB磷酸化［8］，而敲除CREB基因的小鼠嗎啡戒斷反應的行為改變明顯減輕［9］，因此，推測cAMP-CREB通路的功能改變是形成和維持阿片依賴的重要機制。

在本研究中，嗎啡急性用藥，降低了大鼠SCG的pCREB蛋白含量;嗎啡慢性使用后，pCREB蛋白有所上調，并在納洛酮催促戒斷后進一步增高;但各組大鼠的CREB mRNA表達水平均無明顯改變。CREB磷酸化適應性上調的改變與cAMP、快興奮性突觸傳遞及突觸界面結構適應性改變結果相一致，因此我們推測，通過cAMP和pCREB的適應性上調，cAMP-CREB通路將可能通過調節相關神經元蛋白基因的轉錄，導致慢性嗎啡處理后交感神經節突觸傳遞及突觸界面結構的適應性改變，從而參與嗎啡耐受、依賴和戒斷的發生和發展。

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