亮藍G對頸上神經(jīng)節(jié)P2X7受體介導心肌缺血損傷的作用研究

吳 炳，李桂林，涂桂花，彭海英，劉雙梅，彭力超，宋渺渺，梁尚棟，2

(南昌大學醫(yī)學院1.生理學教研室、2.基礎醫(yī)學重點實驗室，江西南昌 330001)

頸上神經(jīng)節(jié)(superior cervical ganglia，SCG)發(fā)出的節(jié)后纖維可影響心臟的功能［1－2］。SCG不是簡單的信號中繼站，對傳入和傳出信號具有整合作用［3］。交感神經(jīng)的傳入纖維傳遞急性心肌缺血傷害性感受信號，進而興奮中樞下達交感傳出信息對心臟功能產(chǎn)生影響。文獻顯示心臟的感覺傳入神經(jīng)元與頸上交感神經(jīng)節(jié)(SCG)神經(jīng)元之間存在相互聯(lián)系，通過頸上交感神經(jīng)節(jié)的節(jié)后神經(jīng)對心臟活動產(chǎn)生影響，從而形成感覺傳入與交感傳出之間的反饋環(huán)路［4－5］。

嘌呤2受體(P2受體)包括 P2X受體亞型(P2X1-7)和P2Y受體亞型［6］。三磷酸腺苷(ATP)及其類似物是P2受體的天然配體。P2X受體為非選擇性陽離子通道，興奮時可引起通道開放，可通透陽離子 Na+、K+、Ca2+，引發(fā)生物學效應［7］。ATP 作用于P2X受體調節(jié)神經(jīng)信息傳遞。由595個氨基酸組成的P2X7受體有395個氨基酸編碼的兩個跨膜區(qū)、包含一個N端和大的胞外環(huán)，P2X7受體位于胞內(nèi)的 C 端長于其它亞型［5，8－9］。

我們實驗室的前期實驗結果顯示P2X3和P2X2/3受體涉及心肌缺血損傷性信息傳遞并導致交感興奮反射［10］。P2X7受體存在于頸上交感神經(jīng)節(jié)［8］，P2X7受體參與多種神經(jīng)功能與病理變化［8］，但頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X7受體是否與心肌缺血損傷相關尚不清楚。本研究通過觀察心肌缺血模型大鼠SCG中P2X7受體水平的變化與心肌缺血功能損傷的關系，及應用P2X7受體特異性拮抗劑亮藍 G(brilliant blue G，BBG)后的影響，了解急性心肌缺血損傷時頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X7受體在損傷性信息導致交感興奮反射信號傳遞中的作用，為心肌缺血病變的預防和治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 心肌缺血實驗動物模型與分組 健康Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)，體質量180－220 g，♀，由南昌大學實驗動物科學部提供。大鼠心肌缺血模型建立方法［11］簡述如下:麻醉后暴露大鼠的聲門，氣管插管后接通小動物呼吸機。在左胸胸骨角第4肋間隙位置縱切皮膚，暴露心臟，用玻璃分針剌破心包膜。用小號縫合針快速穿刺血管底部心肌結扎左心耳與動脈圓錐間的左冠狀動脈前降支(深度約1.5～2.0 mm)，大鼠心電圖出現(xiàn)ST段呈弓背向上抬高時表明成功建立心肌缺血大鼠模型。

SD大鼠隨機分為假手術組、假手術加BBG組、心肌缺血模型組和心肌缺血模型加P2X7受體拮抗劑BBG干預組。假手術加BBG組和心肌缺血模型加BBG干預組腹腔注射P2X7受體拮抗劑BBG(30 mg·kg－1·d－1)，分別連續(xù)注射 20 d。

1.2 藥品與試劑 兔抗P2X7單克隆抗體(Abcam公司)、β-actin抗體(北京中杉金橋)、亮藍G(brilliant blue G，BBG)(美國Sigma-aldrich)。

1.3 大鼠心電圖、血壓和心率測定 腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g體質量)進行麻醉。大鼠麻醉后固定于手術臺，將心電圖電極分別固定在雙上肢和右下肢皮下，進而用Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)記錄標準Ⅱ導聯(lián)的心電圖。

應用BP-2006A智能無創(chuàng)血壓計監(jiān)測假手術組、假手術加BBG組、心肌缺血模型組和心肌缺血模型加P2X7受體拮抗劑BBG干預組大鼠血壓和心率的變化。相同時間內(nèi)重復測量3次大鼠的血壓和心率后取其平均值，由同一人完成每次操作。

1.4 心肌酶測定 應用抗凝玻璃毛細管在麻醉后大鼠的眶后靜脈叢采集約1～2 ml血液。將收集的血液立即離心5 min(3 000 r·min－1)后取上層血漿，用全自動電化學發(fā)光儀(美國羅氏 COBAS E601)檢測各組大鼠血清心肌酶。

1.5 免疫組織化學 冰凍切片大鼠頸上神經(jīng)節(jié)，當神經(jīng)節(jié)切片恢復至室溫后，用PBS(0.1 mol·L－1)洗3次(5 min/次);再用0.3%的H2O2室溫孵育5 min(以降低內(nèi)源性過氧化物酶);0.1 mol·L－1PBS洗3次(5 min/次);封閉液37℃ 孵育1 h;加入兔源并用0.1 mol·L－1PBS稀釋為1∶100的P2X7一抗后4℃ 孵育過夜;用0.1 mol·L－1PBS洗3次(5 min/次);滴加適量生物素標記二抗工作液后37℃孵育 40 min;0.1 mol·L－1PBS 洗3 次(5 min/次);滴入適量過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液(室溫孵育20 min);0.1 mol·L－1PBS洗3次(5 min/次);用DAB顯色、雙蒸水沖洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。

1.6 蛋白印跡 提取各組大鼠頸上神經(jīng)節(jié)提取蛋白，上樣及進行SDS-PAGE蛋白分離電泳，轉膜后進行免疫學檢測。通過Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)分析目的條帶在X線膠片測得的綜合光密度值，以各組β-actin條帶的IOD值標化其蛋白的表達量。1.7 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)用Excel及SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各實驗組數(shù)據(jù)以±s表示，各組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計采用方差分析，組間比較采用LSD法。

2 結果

2.1 心率、血壓及心電圖的變化 心肌缺血大鼠模型組心率、血壓(收縮壓和舒張壓)與假手術組、假手術加BBG組、心肌缺血模型加P2X7受體拮抗劑(BBG)干預組大鼠比較出現(xiàn)明顯加快和增高(P＜0.05)。心肌缺血大鼠模型加BBG干預組的收縮壓、舒張壓與假手術組、假手術加BBG組比較無明顯差異(P＞0.05)。心肌缺血大鼠模型加BBG干預組心率略高于假手術組和假手術加BBG組(P＜0.05)。見Tab 1。

心肌缺血成功建模大鼠的心電圖顯示ST段呈弓背抬高;建模20 d后心肌缺血大鼠模型的心電圖出現(xiàn)深大的病理性Q波，而心肌缺血模型加BBG干預組大鼠無明顯的病理性Q波(Fig 1)。

2.2 心肌酶濃度變化 應用全自動電化學發(fā)光儀(美國羅氏COBAS E601)檢測乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)和心肌肌鈣蛋白T(cTn-I)。心肌缺血模型組的 LDH，CK-MB，CK和cTn-I濃度，與假手術組、假手術+BBG組和心肌缺血模型+BBG組比較明顯增加(P＜0.05)。心肌缺血模型+BBG組CK-MB、CK、LDH和cTn-I濃度較假手術組、假手術+BBG組略有增高(P＜0.05)。見Tab 2。

Tab 1 Value of heart rate and blood pressure(systolic blood pressure and diastolic blood pressure)after 20 days of myocardial ischemia in each group(±s，n=5)

Tab 1 Value of heart rate and blood pressure(systolic blood pressure and diastolic blood pressure)after 20 days of myocardial ischemia in each group(±s，n=5)

*P＜0.05 vs sham group，sham+BBG group and ischemia+BBG group;#P＜0.05 vs sham group and sham+BBG group.

Group Heart rate/min pressure/kPa Sham 332.850 ±36.720 15.928 ±1.591 11.268 ±1.Systolic blood pressure/kPa Diastolic blood 16.246 ±1.578 11.380 ±1.180 087 Sham+BBG 335.650 ±33.671 15.991 ±1.550 11.169 ±1.087 Ischemia 428.650 ±45.752*18.354 ±1.816* 12.443 ±1.228*Ischemia+BBG 389.870 ±38.961#

2.3 頸上神經(jīng)節(jié)P2X7受體免疫反應性 用Image-Pro Plus軟件分析免疫組織化學結果，頸上交感神經(jīng)節(jié)細胞P2X7受體免疫反應性的光密度值在假手術組、假手術+BBG組、心肌缺血模型組、心肌缺血模型+BBG組(n=10)分別為:205.015±20.98、198.52±20.06、403.76 ±41.29、223.83 ±24.36。統(tǒng)計學分析顯示，心肌缺血模型組大鼠頸上神經(jīng)節(jié)P2X7受體蛋白的表達明顯高于假手術組、假手術+BBG組和心肌缺血模型+BBG組(P＜0.05);假手術組、假手術+BBG組和心肌缺血模型+BBG組之間P2X7受體蛋白的表達差異無顯著性(P＞0.05)。見Fig 2。

2.4 頸上神經(jīng)節(jié)P2X7受體的蛋白表達 將蛋白印跡實驗結果通過β-actin標化后顯示頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X7受體蛋白表達的光密度值在假手術組、心肌缺血模型組、假手術+BBG組、心肌缺血模型+BBG組(n=10)分別為:0.98±0.09、1.46±0.13、1.03 ±0.09、0.90 ±0.08。心肌缺血模型組P2X7受體蛋白表達高于假手術組、假手術+BBG組、心肌缺血模型+BBG組(P＜0.05);假手術組、假手術+BBG組和心肌缺血模型+BBG組的P2X7蛋白表達無明顯差異(P＞0.05)。見Fig 3。

3 討論

冠心病及心絞痛是由于心肌缺血和缺氧引起以心前區(qū)疼痛為主要臨床表現(xiàn)的一組綜合征［2，11］。頸部交感神經(jīng)對心功能興奮傳導、心跳頻率調節(jié)、心肌收縮和舒張具有重要作用。頸上交感神經(jīng)節(jié)不是單一的信息中轉站，它可以對心臟感覺信息的傳入信息與交感傳出信息進行整合調控心臟的功能活動［3－5，12］。本研究觀察到相對于假手術組大鼠，心肌缺血模型組大鼠的心率明顯加快、血壓明顯升高。頸上交感神經(jīng)節(jié)節(jié)后交感神經(jīng)末梢可分布于心臟與冠狀血管，急性心肌缺血、缺氧的損傷性感覺信號傳入后可以通過頸上交感神經(jīng)節(jié)節(jié)后交感神經(jīng)加強心臟的興奮性，導致心率加快、血壓升高和心交感神經(jīng)興奮性增強［4－5，12］。本實驗結果顯示心肌缺血大鼠模型心率加快、血壓升高，表明心肌缺血增強交感興奮性活動。

冠心病及心肌損傷使心肌細胞破壞，使血中肌酸激酶、乳酸脫氫酶、肌鈣蛋白升高。乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)可作為觀察心肌缺血損傷程度的血清標志物［13］。實驗結果顯示心肌缺血模型組大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)和心肌肌鈣蛋白T(cTn-I)升高明顯，表明心肌已出現(xiàn)損傷。心肌肌鈣蛋白I(cTnI)是一種高特異性、高靈敏度的心肌損傷標志物。心電圖檢測觀察到心肌缺血模型組大鼠出現(xiàn)深大的異常Q波，表明出現(xiàn)明顯的心肌缺血損傷。

Fig 1 Representative traces of the ECG after 20 days of myocardial ischemia in each group

Tab 2Serum concentrations of LDH，CK-MB，CK and cTn-I after 20 days of myocardial ischemic injury in each group(±s，n=5)

Tab 2Serum concentrations of LDH，CK-MB，CK and cTn-I after 20 days of myocardial ischemic injury in each group(±s，n=5)

*P ＜0.05 vs sham group，sham+BBG group and ischemia+BBG group;#P ＜0.05 vs sham group and sham+BBG group.

Group CK-MB/U·L－1 CK/U·L－1 LDH/U·L－1 cTn-I/μg·L －1 Sham 37.87 ±3.87 480.85 ±47.76 292.85 ±28.83 0.052 ±0.0052 Sham+BBG 42.41 ±4.92 502.84 ±50.92 305.93 ±30.43 0.056 ±0.0043 Ischemia 84.30 ±8.82* 2125.84 ±204.52* 942.64 ±93.61* 0.192 ±0.0185*Ischemia+BBG 65.20 ±6.53# 856.38 ±85.73# 465.90 ±46.85# 0.078 ±0.0071#

Fig 2 Expression of P2X7in SCG tested by immunohistochemistry

Fig 3 Expression of P2X7protein in SCG tested by Western blot

P2X受體參與心血管功能調節(jié)及病理變化過程［6，14］。頸上交感神經(jīng)節(jié)存在 ATP 釋放［15］，組織損傷時可釋放大量 ATP［6］，進而激活 P2X受體，加強心交感神經(jīng)傳出活動。我們實驗室前期的實驗結果表明心肌缺血模型大鼠頸部交感神經(jīng)節(jié)P2X3和P2X2/3表達明顯增加，交感興奮性增強［10］，應用P2X3和P2X2/3受體拮抗劑A-317491可降低心肌缺血大鼠升高的血壓和加快的心率，由此表明頸部交感神經(jīng)節(jié)P2X受體涉及心交感反射。本實驗觀察到缺血模型大鼠術后20 d出現(xiàn)心率加快和血壓升高，當心肌缺血模型大鼠應用P2X7受體拮抗劑BBG干預后可明顯降低升高的血壓和加快的心率，表明BBG可明顯抑制心肌缺血損傷引起心交感傳出神經(jīng)興奮性增強現(xiàn)象。心肌缺血模型大鼠應用BBG預處理后心電圖的異常變化得到改善、心肌缺血模型大鼠血清的乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)和心肌肌鈣蛋白T(cTn-I)水平降低，實驗結果進一步表明P2X7受體拮抗劑BBG可能通過抑制心交感興奮反射對心肌缺血介導的心肌缺血性損傷產(chǎn)生保護作用。

實驗結果顯示心肌缺血損傷后頸上交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P2X7受體的mRNA和蛋白水平表達明顯增加，P2X7受體特異性拮抗劑BBG可降低上調表達的P2X7受體mRNA及蛋白水平。由此提示頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X7受體參與心肌缺血損傷介導的心交感節(jié)后傳出興奮性反射的病理變化，P2X7受體拮抗劑BBG可降低頸上神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P2X7受體mRNA及蛋白水平，抑制頸上交感神經(jīng)節(jié)節(jié)后神經(jīng)介導的交感興奮反射，降低心交感興奮反射引起的血壓升高和心率加快，從而對心肌缺血損傷產(chǎn)生保護作用。

總之，心肌缺血損傷導致頸上神經(jīng)節(jié)P2X7受體表達增加，大量釋放的ATP興奮P2X7受體，引起心交感興奮反射增強，出現(xiàn)心率加快和血壓升高而加重心肌缺血引發(fā)的損傷。P2X7受體拮抗劑BBG可通過降低頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X7受體mRNA及蛋白的上調表達，對心肌缺血損傷介導的心交感興奮反射產(chǎn)生抑制作用，從而減輕心肌缺血損傷，對心臟產(chǎn)生保護作用。

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