杜仲葉酶解液輔助提高醋抗氧化活性的研究

賈春鳳，王 松，戎柯曉，孫曉琦，郝建新，周 方，伏邦炳，干蘇靈，張柏林，*

（1.北京林業大學生物科技學院，北京100083；2.保定學院生化系，河北保定071000；3.陜西明冠食品飲料有限公司，陜西略陽724300；4.江蘇綠揚現代生態農業發展有限公司，江蘇揚州225105）

醋具有較好的抗氧化作用。Shoko Nishidai等[1]研究了醋的抗氧化活性（亞油酸自氧化體和DPPH體系），黑醋的乙酸乙醋萃取物（EK）的抗氧化活性最高。Atsushi Sugiyama等[2]研究表明，一定劑量的葡萄醋和葡萄汁可以降低小鼠心臟病和高血壓的發病率。杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）為杜仲科（Eucommiace-ae）植物，一般以皮入藥，在我國具有悠久使用歷史。近期研究發現，杜仲葉中含有的化學成分和杜仲皮中的極為相似，并且二者具有相近藥理作用[3-4]，且杜仲葉資源豐富易得。因此，杜仲葉作為食品加工原料，在食品中的應用已經進入起步階段，目前市場上主要產品有杜仲茶，但應用到食品中的深加工研究卻鮮有報道。杜仲葉中綠原酸含量相當豐富，綠原酸具有較強的生物活性[5]，其中最主要的是抗氧化作用[6]。張萬峰[7]研究表明，杜仲葉綠原酸（CA）含量為1.27%-4.06%。鑒于《中華人民共和國藥典》將綠原酸定為評價杜仲葉質量優劣的主要技術指標[8]，因此本研究以綠原酸為標志物質對杜仲葉酶解液的抗氧化活性進行探究。許多疾病的發生被認為與氧化有關，如冠心病、癌癥、糖尿病等[9-11]，從而抗氧化物質的研究已經成為目前科研領域的熱門課題。生物材料的抗氧化特性可能是不同抗氧化劑相互作用的結果，表現為協同作用、負協同作用、累加效應[12-13]。本實驗將研究杜仲葉酶解液和醋協同抗氧化作用，為功能性食品的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲葉 陜西省漢中市略陽縣秋季老葉；鎮江香醋 醋酸＞4.00g/100mL，江蘇丹陽市恒君調味品廠；綠原酸標準品 色譜純，上海融禾醫藥科技有限公司；纖維素酶 分析純，九州同業藥品公司；VC分析純，北京奧博星生物技術有限責任公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-Picrylhydrazyl radical，DPPH） 分析純，Sigma公司；三氯乙酸（TCA）、95%的乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等 均為北京化工廠產分析純。

752型紫外可見分光光度計 上海美諾達儀器有限公司；分析天平 上海民析精密科學儀器有限公司；DSY-2-8型恒溫水浴鍋 北京國華醫療器械廠。

1.2 杜仲葉酶解液（EEH）的制備

綠原酸（CA）標準品用95%的乙醇稀釋一系列的梯度，在332nm測定吸光值，繪制曲線，建立方程y=0.0505x+0.0037（R2=0.9995）。式中：x為溶液中綠原酸質量濃度（0～60μg/mL）；y為吸光值。

在酶解溫度為45℃，料液比為1∶10，酶添加量為0.1%，酶解時間2h的條件下，對杜仲葉粉進行酶解，酶解液過膜，并用紫外分光光度計在332nm下測定綠原酸含量。

1.3 杜仲葉酶解液與醋配比方案

以文獻[14-15]中提到的杜仲葉酶解液（EEH）抗氧化活性為依據，以杜仲葉酶解液中綠原酸含量為指標，按不同的體積比進行實驗設計（見表1）。

表1 不同樣品的配比Table 1 Different ratio of eucommia ulmoides oliv leaves enzymatic hydrolysate and vinegar

1.4 抗氧化性能研究方法

1.4.1 清除DPPH自由基性能測定 方法在文獻[16-20]的基礎上略做修改。DPPH溶液的配制：準確稱取4mg DPPH，用適量95%乙醇溶解，然后定容至100mL，得DPPH濃度0.004%，4℃避光保存。配制不同濃度的樣品溶液，同一試管中加入1mL樣品溶液，1mL 0.004%DPPH溶液，搖勻，室溫放置30min。95%乙醇代替樣品做為空白對照。測定各溶液517nm的吸光度。重復3～5次，然后按以下公式計算清除率，清除率越大則抗氧化能力越強。

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中：A0——1mL無水乙醇加入1mL DPPH溶液的吸光值；Ai——1mL樣品中加入1mL DPPH溶液反應后在517nm處的吸光度；Aj——1mL待測液加1mL 95%乙醇的吸光值。

1.4.2 還原能力的測定 方法在文獻[1，19-20]的基礎上略作調整。按1.3得的各樣品分別配制成20μL/mL的待測樣品溶液備用。待測樣品2mL，與2mL磷酸緩沖液（0.2moL/L，pH6.6），2mL 1%K3Fe（CN）6混合，將混合物于50℃溫育25min，然后在混合物中加入2mL 10%三氯乙酸。取上層清液5mL，加入5mL水和lmL 0.1%三氯化鐵，混合均勻，靜置10min后以蒸餾水為空白，700nm下測定吸光值A700。

1.4.3 羥自由基的清除率測定 方法以參考文獻[1，2，20]為基礎并加以改進。具體操作如下：按1.3得的各樣品分別配制成20μL/mL的待測樣品溶液備用。1mL待測樣品中加入6.0mmol/L的水楊酸乙醇溶液（用純乙醇配制）1mL，再加入6.0mmol/L的硫酸鐵溶液1mL，用蒸餾水補足4mL，混勻后加入6.0mmol/L的過氧化氫溶液1mL啟動Fenton反應，搖勻，放置10min后，以蒸餾水作參比，在510nm下測定吸光值。

羥自由基的清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中：Ai—空白對照溶液于510nm下的吸光值；Aj—1mL蒸餾水代替水楊酸，按同法進行Fenton反應，在510nm下的吸光值；A0—1mL蒸餾水代替樣品，按同法進行Fenton反應，在510nm下的吸光值。

1.5 數據分析及處理

每組實驗重復5次，采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行T檢驗和相關性分析，實驗結果用平均值±標準誤差表示。采用Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 酶解液中綠原酸含量

測得杜仲葉酶解液中綠原酸含量為（1.80±0.16）mg/mL。

2.2 杜仲葉酶解液的抗氧化性能研究

2.2.1 酶解液清除DPPH自由基能力研究 圖1顯示，隨著物質含量的增加，各樣品都呈現出先快速上升后逐漸趨于平穩的抗氧化活性趨勢，說明反應液中樣品的含量達到一定值后，再增加物質含量已對樣品抗氧化性沒有影響。當物質含量在5～10μg/mL時，與CA標品、VC標品相比，EEH酶解液清除DPPH自由基的能力較強，這可能因為EEH酶解液中還含有黃酮等其他高抗氧化活性物質。在10μg/mL時，酶解液的DPPH的清除率達到最高值，為88.70%±0.91%。因此，酶解液應用到食品時，其綠原酸含量不能低于10μg/mL。

圖1 VC、CA、EEH清除DPPH自由基能力Fig.1 DPPH free radical-scavenging activity of VC，CA and EEH

2.2.2 酶解液清除羥自由基能力研究 圖2顯示，隨著物質含量的增加，各樣品除羥自由基能力呈現上升趨勢。物質含量為10μg/mL時，EEH、VC和CA清除羥自由基能力幾乎同時達到最高，清除率分別為：47.5510%±1.37%、49.42%±0.94%、28.85%±0.96%，可見酶解液具有較強清除羥自由基能力并且遠遠高于綠原酸標品，這也可能是酶解液中還含有黃酮其他高抗氧化活性物質所致。當樣品含量大于10μg/mL，隨著樣品含量的增加，酶解液清除羥自由基的能力逐漸平緩。因此，在實際應用時綠原酸添加量最好保持在10μg/mL以上，以保證其效果的穩定性。

圖2 VC、CA、EEH清除羥自由基能力Fig.2Hydroxyl（OH）radical-scavenging activity of EEH，VCand CA

2.2.3 酶解液還原能力研究 圖3顯示，隨著物質含量的增加，各樣品還原能力呈現上升趨勢。與VC和CA標品比較，EEH酶解液還原能力較弱。但當物質含量為0.2mg/mL時，VC和CA還原能力已經呈現平穩的趨勢，而EEH還是上升的趨勢。因此可以推測得出，當EEH的含量繼續增加，大于0.3mg/mL，還原能力會繼續增加，直至出現平穩的趨勢。

圖3 VC、CA、EEH的還原能力Fig.3 Reducing power of EEH，VCand CA

2.3 酶解液和醋協同抗氧化性能研究

2.3.1 各種樣品清除DPPH自由基能力比較 圖4可見五種樣品清除DPPH自由基的能力強弱順序為：EEH＞EV19＞EV19對照＞EV9＞EV9對照。EEH酶解液清除DPPH自由基活性最強，顯著高于除EV19的其他樣品（p＜0.05）。EV9對照樣品清除DPPH自由基活性最弱，顯著低于其他各個樣品（p＜0.05）。

圖4 不同樣品清除DPPH自由基的能力Fig.4 DPPH free radical-scavenging activity of different sample

2.3.2 各種樣品還原能力比較 樣品還原能力的強弱可用OD值的大小表示，因此由圖5可知，當體積含量為20μL/mL時，各個樣品還原能力的強弱順序為EV19＞EV19對照＞EV9＞EV9對照＞EEH，兩個配制樣品EV9、EV19的還原能力分別顯著高于EEH以及各自的對照。

圖5 不同樣品的還原能力Fig.5 Reducing power of different sample

2.3.3 各種樣品清除羥自由基能力比較 不同樣品清除羥自由基能力見圖6。清除羥自由基能力強弱順序為：EV19＞EEH＞EV19對照＞EV9＞EV9對照，可見，EEH的添加能夠提高醋清除羥自由基的能力，配制杜仲醋清除羥自由基能力與添加EEH相關，杜仲酶解液和醋具有協同清除羥自由基的作用。

圖6 不同樣品清除羥自由基能力Fig.6 Hydroxyl radical-scavenging activity of different sample

由表2可知，兩種配制樣品（EV9和EV19）的抗氧化活性分別與EEH、醋抗氧化活性的相關系數較大，可見，EEH和醋對杜仲醋的抗氧化活性影響較強，共同增強了杜仲醋的抗氧化能力。因此，EEH與醋具有協同抗氧化作用，EEH能夠輔助提高醋的抗氧化性能。

表2 成對樣本相關系數Table 2 Correlation coefficient of paired samples

3 結論

3.1 杜仲葉酶解液中CA含量為（1.80±0.16）mg/mL。通過體外抗氧化實驗得出，杜仲葉酶解液具有較強的抗氧化性能；當酶解液應用到食品時，產品中綠原酸含量不得小于10μg/mL。

3.2 杜仲葉酶解液和醋具有較好協同抗氧化作用，杜仲葉酶解液能夠顯著提高醋的抗氧化活性（p＜0.05），為杜仲葉在食品中的應用提供了新的理論支持。

[1]ShokoNISHIDAI，YoshimasaNAKAMURA.Kurosea traditional vinegar produced from unpolished rice supresses lipid peroxidation in vitro and in mouse skin[J].Biosci Piotechno Bioehel，2000，64（9）：1909-1924.

[2]Atsushi.Aeute cardiovascular effects of a new beverage made of wine vinegar and grape juice，assessed using an in vivo rat[J].Nuterition Researeh，2003，23：1291-1296.

[3]劉迪.杜仲葉抗疲勞功效分子機制與抗氧化作用關聯性研究[D].西安：陜西科技大學，2011.

[4]周琳娜，張紅霞，張艷艷，等.纖維素酶輔助水解杜仲葉醋的發酵條件[J].食品工業科技，2012，33（12）：201-204.

[5]JainPK，Di Tomaso E，Duda Dqetal.Angio genesisin brain tumors[J].Nature Reviews Neuro seience，2007（8）：610-22.

[6]卞合濤.綠原酸對氧化應激損傷內皮細胞的保護作用及機制探討[J].南京：南昌大學，2011.

[7]張萬峰.不同月份杜仲葉中綠原酸含量的研究[J].安徽農業科學，2008，36（19）：8145-8146.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：化學工業出版，2004：114-115.

[9]Dean RT，Fu SL，Stocker R，et al.Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation[J].Biochemical Journal，1997，324（1）：1-18.

[10]Benzie IFF.Evolution of antioxidant defense mechanisms[J].European Journal of Nutrition，2000，39（2）：53-61.

[11]Willcox JK，Ash SL，Catignani GL.Antioxidants and prevention of chronic disease[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2004，44（4）：275-295.

[12]Ho Jin Heo，Young Jun Kim，Donghwa Chung.Antioxidant capacities of individual and combined phenolics in a model system[J].Food Chemistry，2007，104：87-92.

[13]Liu Donghong，John Shi，Alejandra Colina Ibarra.The scavenging capacity and synergistic effects of lycopene，vitamin E，vitamin C，and b-carotene mixtures on the DPPH free radical[J].LWT-Food Science and Technology，2008，41：1344-1349.

[14]葉文峰，辛增平，冷桂華.杜仲葉葡萄醋復合飲料的研制[J].食品科技，2008，34（3）：73-75.

[15]宗留香，肖青苗.杜仲保健醋的配制[J].中國調味品，1999，7：12-14.

[16]Reiko Ohmori，Tamami Iwamoto，Motomi Tagb.Antioxidant activity of various teas against free radicals and LDL oxidation[J].Lipids，2005，40（8）：849-853.

[17]張風云，毛富春.毛細管區帶電泳法篩選提取杜仲葉中氯原酸的方法[J].西北藥學雜志，1996，11（2）：66.

[18]國家藥典委員會.中國藥典2010[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[19]高錦明，張鞍靈，張康健.綠原酸分布、提取與生物活性研究綜述[J].西北林學院學報，1999，14（2）：73.

[20]Chiu Y K，Chang X C，Takeshi D.Endothelium dependent vasorelaxant effects of the aqueous extracts of the eucommia ulmoides oliv leaf and nark：Implications on their antihypertensive action[J].Vascular Pharmacology，2004，40：229-235.