hTERT m RNA在胃癌中表達及其與預后的關系

門樹成 黃寶俊

1.沈陽二四五醫院外科，沈陽 110043；2.中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤外科，沈陽 110001

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，就診患者中約90%為進展期胃癌，極易發生侵襲、轉移，預后差，嚴重威脅著人們的身體健康。探討胃癌侵襲轉移的分子機制，尋找與其相關的生物學標志物是當今腫瘤學研究的熱點之一[1]。端粒酶是一種與細胞永生化和腫瘤形成相關的核糖核蛋白酶，它能夠以細胞內部的一段RNA為模板合成端粒末端重復序列而延長端粒，從而使細胞永生化。人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是人類端粒酶的催化亞單位，是端粒酶活性高低的限速酶。hTERT的表達與端粒酶活性呈正相關，可以反映端粒酶活性的高低[2-4]。研究已證實，端粒、hTERT與正常細胞生長調控及惡性腫瘤之間密切相關。目前有關hTERT在胃癌中的研究多集中在胃癌發生的始動階段，hTERT高表達可促進胃癌的發生[5]。然而，hTERT與胃癌侵襲、轉移及預后的關系研究相對較少。本研究選取52例胃癌患者為研究對象，應用RT-PCR方法檢測hTERT mRNA在同一患者的正常胃黏膜、胃癌原發灶及轉移灶（即轉移淋巴結）中的表達，通過隨訪，系統研究hTERT mRNA在胃癌中的表達情況及其與胃癌惡性生物學行為和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2001年9月～2002年9月中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤外科52例胃癌患者為研究對象，收集患者新鮮大體組織標本。在手術切除胃癌大體標本30 min內，切取胃原發癌灶和正常胃黏膜及轉移淋巴結，放入消毒滅菌的EP管中，于液氮中速凍0.5 h后轉入-70℃冰箱中凍存等待檢測，以上標本均經病理證實，并保留其石蠟標本。對52例患者進行隨訪，主要通過門診復查、電話信函問詢、派出所戶籍查詢等，隨訪終點為2010年9月，隨訪率為100%，隨訪時間為8～106個月，平均48.5個月。

1.2 RT-PCR檢測hTERT mRNA的表達

嚴格按照TRIzol試劑盒說明書進行操作，提取所有新鮮大體標本總RNA，測定其OD260、OD280值，對總RNA進行定量；應用RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。取高質量總RNA 1μg進行逆轉錄合成第一鏈cDNA，然后取3μl cDNA水溶液進行 PCR擴增，具體條件：94℃ 5 min，94℃40 s、58℃ 45 s、72℃ 60 s（30 個循環），72℃ 7 min。 hTERT 基因 引 物 序 列 為 ：5′-CGTCCAGACTCCGCTTCAT-3′，5′-TGCTTCTTGTGGTCCTCAGA-3′，產物為 340 bp；內參基因GAPDH 引物序列為：5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′，5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，產物為 227 bp。 擴增產物經梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染色檢測，詳細步驟參見文獻[6]。用Fluorchem V2.0 Stand Alone電泳凝膠掃描儀對電泳凝膠進行掃描，應用其自帶的分析軟件進行灰度（A）測定，電泳中有擴增產物條帶者為陽性，無擴增產物條帶者為陰性；計算 hTERT mRNA表達指數（ImRNA），I=A（hTERT）/A（GAPDH），ImRNA與其在組織中的表達量呈正比。

1.3 統計學方法

應用SPSS 19.0統計軟件分析數據，應用配對均數t檢驗比較hTERT mRNA在胃原發癌灶、正常胃黏膜、淋巴結轉移癌中表達的差異；應用單因素方差分析評估其在胃原發癌中表達與胃癌生物學行為的相關性；應用Kaplan Meier分析繪制生存曲線，采用Log Rank檢驗評估其在胃原發癌灶中表達與預后的關系，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hTERT mRNA在胃原發癌灶、正常胃黏膜和淋巴結轉移癌中表達情況的比較

與正常胃黏膜（0.022±0.093）相比，hTERT mRNA 在胃原發癌灶中（0.515±0.352）表達水平（t=9.969，P＜0.01）和淋巴結轉移癌中（0.729±0.578）表達水平（t=7.814，P＜0.01）明顯增高，且在淋巴結轉移癌中增高更明顯，而其在胃原發癌灶和淋巴結轉移癌中表達水平差異無統計學意義（t=1.602，P=0.117）。在胃正常黏膜中多數表達陰性或僅有微弱條帶。內參基因GAPDH在不同標本中表達水平基本一致（圖 1）。

圖1 hTERT mRNA在胃原發癌灶、正常胃黏膜和淋巴結轉移癌中的表達（RT-PCR電泳圖）

2.2 hTERT mRNA在胃原發癌灶中表達與胃癌生物學行為的相關性

經過單因素方差分析發現，胃原發癌灶中hTERTmRNA表達水平在浸潤型癌、腫瘤浸透漿膜面、漿膜侵犯面積＞20 cm2、淋巴結分期（7thTNM 分期）晚者（N3）者中表達水平明顯增高，而在限局型癌、腫瘤未浸透漿膜面、漿膜侵犯面積≤20 cm2、淋巴結分期早者（N1～2）中表達水平相對較低。其表達水平與其他臨床病理因素無明顯相關性（如腫瘤大小、部位、分化程度、生長方式、有無脈管癌栓，患者性別、年齡等）（表 1）。

表1 hTERT mRNA在胃原發癌灶中表達水平與胃癌生物學行為的相關性

2.3 hTERT基因mRNA表達與胃癌患者預后的相關性

將hTERT mRNA在胃原發癌灶中表達水平以平均值為界分為高低兩組（其表達指數平均值為0.515），高于平均值者為高表達，低于平均值者為低表達，兩組各26例。分析兩組胃癌患者的生存情況，并繪制生存曲線（圖2）。經Log Rank檢驗發現，hTERT mRNA低表達組比高表達組預后明顯好（χ2=14.20，P=0.0002）；hTERT mRNA 低表達組患者5年生存率為60.04%，高表達組患者為17.41%，兩組差異有統計學意義（P＜0.05）。在本組患者中，15例腹膜復發轉移者中有10例為hTERT mRNA高表達，提示hTERT mRNA高表達可能與胃癌腹膜復發轉移關系密切。

圖2 hTERT mRNA表達高低兩組患者的生存曲線

3 討論

隨著分子生物學的發展，端粒、端粒酶與腫瘤關系的研究越來越引起人們的重視。研究表明，hTERT在胃黏膜腸化生、異型增生及胃癌中表達均明顯高于正常胃黏膜，提示hTERT表達增高是胃癌發生的極早期事件，在胃癌發生的始動階段起重要作用[5，7-9]。在檢測胃癌患者外周血中hTERT mRNA表達的研究中發現，其表達率明顯高于胃良性病變者和健康人，表明其可以作為胃癌早診和預測微轉移的分子生物學指標之一，這在國內外研究中均得到證實[10-13]。

如上所述，目前有關hTERT在胃癌中的研究多集中在胃癌發生的始動階段，有關hTERT mRNA與胃癌侵襲、轉移、預后關系的報道相對較少，且意見不一。賈樹范等[9]報道hTERT的表達與腫瘤浸潤深度、組織分化程度、淋巴結轉移及Bormann分型、遠處轉移密切相關。王維等[14]報道hTERT的表達程度與胃腺癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期及病理類型有密切關系。本研究發現hTERT基因mRNA在胃原發癌灶和淋巴結轉移癌中表達增高，而癌旁正常胃黏膜中表達極弱或不表達，而且在轉移灶（淋巴結轉移癌）中表達增高更為明顯。深入研究其與胃癌臨床病理因素之間的關系時發現hTERT mRNA在胃原發癌灶中表達水平與胃癌浸潤深度、外科分型、漿膜侵犯面積、淋巴結分期（即轉移程度）密切相關。在腫瘤浸透胃漿膜面、浸潤型癌、漿膜侵犯面積大及淋巴結轉移數量多（7枚以上）的胃癌患者中，hTERT mRNA表達水平顯著升高。有學者研究發現腹腔沖洗液中端粒酶活性與胃癌分化程度、浸潤深度、漿膜受侵面積和腹膜轉移密切相關[15]。結合文獻及本研究結果表明，hTERT具有促進胃癌侵襲轉移的能力，與胃癌的惡性生物學行為呈正相關。

既然hTERT mRNA與胃癌的惡性生物學行為呈正相關，可以推論其可能影響患者的預后。本研究進行生存分析時發現，hTERT mRNA高表達組較低表達組明顯預后不良，5年生存率分別為17.41%和60.04%，與文獻報道基本一致[16-17]。進一步分析發現15例腹膜復發轉移者中有10例為hTERT mRNA高表達。本研究發現hTERT表達水平與TNM中N分期呈正相關，提示hTERT基因與胃癌轉移復發密切相關，有可能成為監測胃癌轉移復發新的分子標志物和潛在的分子治療靶標，但是其詳細機制有待進一步研究探討。端粒酶啟動子甲基化可能與其高表達密切相關[18-19]。

綜上所述，胃癌組織中hTERT mRNA的表達與胃癌的浸潤、轉移及患者的生存期密切相關，檢測hTERT mRNA在胃癌組織中的表達情況，有助于判斷胃癌患者的轉移情況和預后，可更好地指導胃癌治療。

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