不同加工方法杜梨葉中鞣質的含量測定

王瑞華，侯彩婷，鄒昀員，田易玲，劉玉紅，徐凌川

(山東中醫藥大學藥學院，山東濟南250355)

杜梨(Pyrus betulaefolia Bge.)為薔薇科梨屬落葉喬木，又名棠梨、海棠梨、野梨子、土梨，常作為庭蔭樹、防護林種植于園林及作為砧木［1］。杜梨各個部分均有保健價值［2］，其果實入藥，具有消食止痢、治腹瀉之效;枝、葉入藥可治霍亂、吐瀉不止、轉筋腰痛、反胃吐食;樹皮入藥可治皮膚潰瘍。鞣質又稱單寧，是保證杜梨色、香、味的一個重要成分，是一類比較復雜的具有沉淀蛋白質性質的水溶性多元酚類化合物，廣泛存在于植物中。近些年來，隨著分析、分離手段及活性成分研究的進步，逐漸發現鞣質具有許多保健價值［2］及藥理活性［3］，可以抗脂質過氧化［4］、清除活性氧［5］，且具有抗艾滋病病毒(HIV)［6］和抗腫瘤［7］等作用，臨床應用日益受到重視。

目前關于杜梨的研究主要集中在種子、幼苗［8－9］，作為砧木嫁接梨樹，杜梨葉氨基酸、礦質元素含量測定［10］，多糖［11］、根皮苷［12］、總黃酮［13］及杜梨果實揮發油含量測定［14］等方面，本實驗測定了不同加工方法杜梨葉中的鞣質含量，為其加工方法選擇及開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品:杜梨葉1#為日曬夜露傳統制法的干燥品，杜梨葉2#為經過渥堆發酵后的干燥品，均為湖南省白沙溪茶廠有限責任公司質檢部提供，粉粹后過40目篩;沒食子酸對照品(批號 110831-200803，純度按含C7H6O5計為90.1%，供含量測定用)由中國藥品生物制品檢定所提供;其它試劑均為分析純;磷鉬鎢酸試液的配制［15］:取鎢酸鈉100 g，鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸100 mL，磷酸50 mL，加熱回流10 h，放冷，再加硫酸鋰150 g，水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去殘留的溴(約15 min)。冷卻，加水稀釋至1 000 mL，濾過，即得。本液不得顯綠色(如放置后變為綠色，可加溴0.2 mL，煮沸除去多余的溴即可)。

1.2 儀器與設備

Varian Cary 100紫外－可見分光光度計美國瓦里安公司;KQ500E超聲儀，江蘇昆山超聲儀器有限公司;FA1104萬分之一電子天平，上海精密儀器公司;FW-100高速萬能粉碎機，北京市永光明醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對照品5 mg，置100 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含沒食子酸0.05 mg)。

1.3.1.2 供試品溶液的制備

分別取不同加工方法的杜梨葉粉末3.5 g，精密稱定，置250 mL棕色容量瓶中，加水150 mL，放置過夜，超聲處理10 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置(使固體物沉淀)，濾過，棄去初濾液50 mL，精密量取續濾液20 mL，置100 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.2 吸收波長的測定

取對照品和供試品溶液各2.0 mL，分別置25 mL棕色容量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液l mL，再分別加水10 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應的試劑為空白，于200～800 nm處掃描即得。

1.3.3 標準曲線的制備

精密量取對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 25 mL 棕色容量瓶中，編號依次為 1 ～6號，各加入磷鉬鎢酸試液 1 mL，再分別加水 11.5，11，10，9，8，7 mL，用 29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應的試劑為空白，參照紫外－可見分光光度法［15］，在吸收波長下測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準線。

1.3.4 精密度實驗

取4號對照品顯色后溶液，吸收波長處測定吸光度，連續測定6次，在最大吸收波長處測定吸光度，計算RSD值。

1.3.5 穩定性實驗

取同一批供試品，按供試品溶液的制備方法操作，吸收波長處測定吸光度，每隔若干時間測定一次，連續考察3 h，共測定6次，計算RSD，分析供試品溶液的穩定性。

1.3.6 重復性實驗

取杜梨葉1#粉末，依上述方法處理樣品6份，按樣品含量測定方法測定，計算RSD，觀察其重復性。

1.3.7 加標回收實驗

取已知鞣質含量的供試品(杜梨葉1#粉末2.3 g)6份，精密稱定量，置250 mL棕色容量瓶中，分別加入近等量的沒食子酸對照品，按供試品溶液制備及1.3.9樣品測定方法測定，并計算鞣質的平均回收率及RSD。

1.3.8 最低檢測限和定量限

該方法測定最低檢測限為 0.17 μg/mL，定量限為 0.51 μg/mL。

1.3.9 樣品含量測定

總酚:精密量取供試樣品溶液2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，參照標準曲線的制備方法，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL。依法測定吸光度，從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)并計算，即得。

不被吸附的多酚:精密量取供試品溶液25 mL，加至已盛有干絡素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，參照標準曲線的制備方法，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，依法測定吸光度，從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)并計算，即得。

按下式計算鞣質的含量:鞣質含量=總酚量－不被吸附的多酚量。

2 結果

2.1 吸收波長的測定

對照品溶液及樣品溶液在760 nm處均有最大吸收，故確定其吸收波長為760 nm。

2.2 標準曲線的繪制

在760 nm下測定對照品溶液吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，得回歸方程為:Y=0.0009X+0.004 1，r=0.997 9，結果表明沒食子酸在1～10 μg/mL之間呈良好線性關系。標準曲線見圖1。

2.3 精密度實驗

在波長760 nm處測定吸光度，RSD=0.31%(n=6)，結果表明儀器精密度良好。

2.4 穩定性實驗

待供試品溶液顯色后，在760 nm下測定吸光度，每隔若干時間測定一次，連續考察3 h，共測定6次，結果表明供試品溶液顯色后在30 min內吸收度上升較大，在30～60min內吸光度穩定，吸光度RSD=0.47%。表明供試品溶液在30～60 min穩定，故選擇在30～60 min內測定。

2.5 重復性實驗

供試品溶液顯色后，在760 nm下按樣品含量測定方法測定吸光度，RSD=1.27%(n=6)，結果表明重復性良好。

2.6 加標回收實驗

已知鞣質含量的供試品溶液加入近等量的對照品，在760 nm下按供試品溶液制備及1.3.9項下樣品測定方法測定，計算得鞣質的平均回收率為98.58%，RSD=0.51%(n=6)。結果見表1。

圖1 沒食子酸標準曲線圖Fig.1 Standard curve of gallic acids

表1 加標回收實驗結果Table 1 Spike recovery rate of tannin in the leaves of Pyrus betulaefolia Bge.and RSD

2.7 樣品中鞣質的含量測定

供試品溶液顯色后，在760 nm下按樣品含量測定方法測定吸光度，杜梨葉1#鞣質含量為0.58% ～0.62%，鞣質平均含量為0.60%，RSD=2.64%(n=5);杜梨葉2#未檢測出鞣質。結果表明，傳統制法的杜梨葉鞣質含量高于渥堆發酵后的。樣品中鞣質的含量測定結果見表2。

表2 不同加工方法杜梨葉中鞣質的含量測定結果Table 2 Determination result of tannin in the leaves of Pyrus betulaefolia Bge.with different processing methods

3 討論

現有中藥鞣質的含量測定方法比較多，最常見的有皮粉法、干絡素法、絡合量法、比色法和磷鉬鎢酸－干絡素法［16］。皮粉法是現在國際上較公認的測定方法，但樣品耗用量大，測定時間長且無選擇性，測定結果往往偏高，一般只適用于鞣質含量較高的生藥，而且皮粉試劑的供應和質量都較難保證。磷鉬鎢酸－干絡素法專屬性強，重復性及靈敏度高，實驗周期短，操作簡單［17］。2005及2010年版《中華人民共和國藥典》中鞣質含量測定方法皆為磷鉬鎢酸－干絡素法，故本實驗選擇該方法測定杜梨葉中的鞣質含量。由于鞣質易氧化，所以實驗應在避光條件下操作。因鞣質受熱不穩定，故選用室溫浸提過夜提取。

本實驗結果表明，不同加工干燥方法所測得杜梨葉中鞣質含量有所不同，其中未發酵杜梨葉中鞣質平均含量為0.60%，渥堆發酵干燥的杜梨葉檢測到有信號，但未測出鞣質含量。原因可能是杜梨葉在渥堆發酵加工過程中的高溫使其鞣質發生一系列的氧化、聚合、縮合反應，產生大量的水溶性氧化產物(主要是色素類多酚)和非水溶性轉化物(主要是與蛋白質結合的不溶性大分子物質)［18］，使發酵后杜梨葉中的多酚類物質減少，致使鞣質含量極低，不易檢測出;另一方面在渥堆發酵過程中經微生物的作用，鞣質降解，但具體原因還有待進一步研究。因此，在選擇這兩種加工方法時，如果杜梨葉煎煮后的口感和色澤差別不大，宜選擇日曬夜露傳統的加工方法。

［1］渝德浚.中國植物志［M］.北京:科學出版社，1974:366.

［2］李娜，楊文慧，王明，等.杜梨養生保健價值淺談［J］.安徽農業科學，2011，39(32):19803，19805.

［3］栗世婷，張曉霞，吳蓉瑛.鞣質藥理活性的研究進展［J］.疾病監測與控制雜志，2010，4(7):395－397.

［4］張杰，詹炳炎，姚學軍.中藥石榴皮對生殖器疤疹病毒的滅活作用及其機理探討［J］.中國中藥雜志，1995，20(9):556－558.

［5］陳會良，商常發.抗衰老中藥對自由基清除作用的研究進展［J］.中國中醫藥雜志，2007，5(7):14－17.

［6］張朝鳳，孫啟時，王崢濤，等.烏藥莖中鞣質成分及其抗HIV-1整合酶活性研究［J］.中國藥學雜志，2003，38(12):911－914.

［7］趙小亮，周忠波，白紅進，等.杜梨果實熱水提取物對H22小鼠的抗腫瘤作用［J］.時珍國醫國藥，2007，18(12):2897－2898.

［8］程奇，吳翠云，阿依買木.不同處理對梨種子休眠與萌發的影響［J］.塔里木大學學報，2005，17(1):28－30.

［9］劉潤進，袁玉清，祝軍.杜梨幼苗根系生長狀況觀察［J］.萊陽農學院學報，1998，15(3):180－183.

［10］趙小亮，鄧芳，王金磊，等.杜梨葉片中氨基酸及礦質元素含量的測定［J］.塔里木大學學報，2007，19(2):57－59.

［11］王少杰，張嶺苓，徐凌川，等.不同加工方法的棠梨葉中總多糖含量測定［J］.山東科學，2011，24(4):15－17，49.

［12］殷法杰，秦國培，蔣海強，等.杜梨葉中根皮苷含量測定［J］.山東中藥雜志，2011，30(3):200，215.

［13］張嶺苓，李楠，徐凌川，等.不同炮制方法的杜梨葉中總黃酮含量測定［J］.食品科技，2011(10):269－271.

［14］吳瑛，趙小亮.杜梨果實揮發油化學成分的GC-MS分析［J］.安徽農業科學，2007，35(19):5659－5660.

［15］曾元兒.中國藥典2010版(一部)［M］.廣州:中山大學出版社，2010.

［16］厲博文，張東，劉為廣，等.紫萁貫眾中鞣質的含量測定［J］.中國中醫藥信息雜志，2010，17(11):45－46.

［17］王珅，魯靜.中藥材中鞣質含量測定方法的研究［J］.中國藥事，2004，18(6):361－364.

［18］劉小玲，李穎，姜元欣，等.廣西六堡茶主要特征成分分析［J］.北京工商大學學報:自然科學版，2012，30(1):46－50.