微流控芯片上電色譜聚合物整體柱研究進展

鄭暉，李秋順，馬耀宏，高廣恒，史建國

(山東省生物傳感器重點實驗室，山東省科學院生物研究所，山東濟南250014)

微流控芯片(microfluidic chip)是上世紀 90年代初 Manz等［1］提出的以微機電系統(tǒng)(microelectromechanical systems，MEMS)技術為基礎的微全分析系統(tǒng)(miniaturized total analysis systems，μTAS)，也稱為芯片實驗室(lab on a chip)。在過去20年中，微流控芯片已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，這與毛細管電泳技術在芯片上的成功應用密不可分［2－5］。而隨著微加工和色譜技術的發(fā)展，微流控芯片技術逐漸應用于色譜這一常規(guī)分析中應用最廣泛的技術［6］中。芯片上的微色譜技術除具有色譜的優(yōu)點外，還具有系統(tǒng)微型化、集成化和自動化的特點，有廣闊的應用前景。

由于微芯片上流體通道很細(幾十微米或更小)，填充固定相后流體阻力大，驅(qū)動流體所需壓力遠高于常規(guī)HPLC的壓力，芯片本身和色譜柱均難以承受，限制了機械泵驅(qū)動微芯片色譜的發(fā)展。而上世紀90年代，Ramsey研究組首次將毛細管電色譜(CEC)技術應用于微芯片平臺［7］，可利用電場產(chǎn)生的電滲流(electroosmotic flow，EOF)來驅(qū)動液體，避免了體系高壓。此后，微芯片電色譜逐漸受到了國內(nèi)外研究者的重視［8－9］。

色譜柱是色譜分離技術的關鍵，由于微芯片尺度和性質(zhì)的特點，微芯片上色譜柱與常規(guī)色譜柱存在不少差異。本文介紹當前在微流控芯片上應用的幾種主要的微色譜柱類型，并分析各自的優(yōu)劣，重點綜述當前微流控芯片上電色譜聚合物整體柱的研究進展。

1 微流控芯片色譜柱類型

目前微流控芯片上色譜柱的類型主要有開管型色譜柱、填充色譜柱和整體柱等。

開管色譜柱的制作最為簡單。Jacobson等［7］在玻璃芯片微通道鍵合C18制成開管色譜柱，并用電色譜分離香豆素。Kutter等［10］在更短的通道中鍵合C18并縮短了分析時間。由于微芯片具有小管徑和淺通道的結構，此類色譜柱降低了塔板高度并提高柱效，但同時會導致柱容量降低，使系統(tǒng)容易過載，實用性不高。

相對于開管色譜柱，填充色譜柱有更高的比表面積和柱容量。同時，多種商品化的基體和填充材料方便了復雜樣品的分離分析，因此填充柱的應用更為廣泛。Gaspar等［11］利用彈性的PDMS材料，通過施加氣壓形成局部錐形截留結構，得到填充柱，其柱長和位置可通過改變壓力和填充時間來控制。填充色譜柱還被用于3種頭孢菌素類抗生素的電色譜分離［12］。Park等［13］采用溶劑蒸發(fā)法填充800 nm粒徑硅膠顆粒形成色譜柱，微球隨液體在毛細力作用下進入通道并自動聚集，填滿通道，他們在2 mm長的分離通道中15 s內(nèi)分離了4種氨基酸。

填充柱的缺陷是填充不均勻，易導致峰拖尾、基線噪聲大和產(chǎn)生氣泡。近年來發(fā)展的多孔聚合物整體柱、硅膠整體柱等整體柱技術具有高通透性和高柱空間利用率，與填充柱相比優(yōu)勢明顯［14］。

2 聚合物整體柱研究進展

聚合物整體柱從制作工藝上主要可分為三類，即原位合成整體柱、后修飾整體柱和結合微加工技術的整體柱。

2.1 原位合成聚合物整體柱

原位合成整體柱是將單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑溶于致孔劑，在一定溫度或紫外線作用下，于微芯片通道的原位合成聚合物，再沖洗除去致孔劑和殘余原料得到。

反相柱是微芯片色譜中應用最多的固定相。早期的毛細管色譜和微芯片色譜研究已經(jīng)成熟地運用了原位合成的聚合物整體柱，常用的是以PMMA、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯為基礎的聚合物。近年來，研究者使用了很多新的單體來制備聚合物整體反相柱，如在PMMA類整體柱中使用肉桂酸、甲基丙烯酸丁酯、辛基甲基丙烯酸甲酯等［15］做為單體，新型的C14和C16的聚丙烯酰胺類整體柱［16］以及陽離子硬脂－丙烯酸酯［17］整體柱等。Bisjak等［18］利用原位共聚合制備了PA-PDA整體柱，該柱具有強機械穩(wěn)定性，可用于分離蛋白和寡聚核酸。Li等［19］把單壁碳納米管與氯甲基苯乙烯(VBC)原位共聚合，得到新型整體柱。也有研究在芯片上集成多個組件形成聯(lián)合色譜系統(tǒng)，如Liu等［20］在芯片上通過原位聚合集成固相萃取柱和反相色譜柱，并用于富集、分離多肽和牛血清白蛋白酶解產(chǎn)物。

離子交換在電色譜中非常重要。Gu等［21］制備了磺酸基強陽離子交換整體柱，將該柱用于分離多肽時，其離子結合能力、峰容量、分辨率都非常高，但表現(xiàn)出相對強的疏水性。對于芯片電色譜而言，有強離子相互作用的離子交換柱非常重要。Wu等［22］利用原位合成法得到強離子交換柱，單體SEMA提供硫酸基團以產(chǎn)生電滲流，而聚合物上帶有的負電基團起到陽離子交換作用。由于該聚合物骨架的疏水性，該柱在分離多肽時，實質(zhì)是反相/離子交換柱。Fu等［23］則用MEAMS和EDMA原位制備了反相/強陰離子交換柱，其表面的氨基具有產(chǎn)生電滲流和陰離子交換的作用，而疏水的骨架又能起反相柱的作用。

除研究可用單體外，新的工藝和制備方法的研究也取得了很大發(fā)展。通過調(diào)整單體、交聯(lián)劑、致孔劑之間的比例關系，研究者可以很好地控制所得到整體柱的通透性和柱效［24］。通過制備有濃度梯度的單體混合物溶液，還可以原位制備具有梯度的反相整體柱。具有梯度的整體柱與沒有梯度的整體柱相比，可以表現(xiàn)出更高的效率和分辨率［25］。還有的研究者改變了流道截面上只有一種柱介質(zhì)的常規(guī)工藝，利用孔層開管柱(porous layer open-tubular，PLOT)的方法在截面上制備出多種柱介質(zhì)的整體柱［26］，并成功用于分離生物樣品。這種方法不但提供了很好的通透性，也顯著提高了峰容量。

雙親性和兩性聚合物近來也更多地運用到芯片電色譜柱的制備中［27］。含有疏水和親水基團的聚丙烯酰胺整體柱就是典型的雙親性柱，可以用作正相或反相柱。Hoegger和Freitag［28］制備了帶有磺酸基的雙親性聚丙烯酰胺整體柱，并用于帶電氨基酸和多肽的電色譜分離。

2.2 后修飾聚合物整體柱

原位聚合得到的整體柱并不總是能滿足特定的色譜分離需求。在原位聚合時，很多功能團會包埋在顆粒內(nèi)部，而不在表面上，因此柱性能會明顯降低。采用后修飾的方法在柱表面生成功能團則會大大改善這一問題。

聚合物整體柱的后修飾方法很多，使用最多的方法是在聚合物表面接枝。利用環(huán)氧、芐氯等［29］基團接枝的方法報道比較早，近年，利用甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)的環(huán)氧基團的接枝方法較為流行，并成功運用到離子交換色譜、親和色譜、pH梯度色譜等芯片色譜柱的制備中。

反相柱的后修飾需求并不多，但Li等［30］利用簡單方法在整體柱表面修飾C18基團，以提高蛋白質(zhì)分離的分辨率和通量，從而用于蛋白質(zhì)組學研究。Dong等［31］在GMA柱上固定了賴氨酸。當分離電中性分析物時，起到反相柱的作用。而對于帶電分析物，靜電相互作用、電泳遷移作用和疏水相互作用則共同生效。

用于芯片電色譜的后修飾離子交換柱也有報道。Bisjak等［32］在GMA柱上接枝氨基得到陰離子交換柱。Wieder等［33］發(fā)展了這一方法，使用兩步法獲得了類似機制的強陰離子交換柱。Wei等［34］通過在GMA上接枝制備了一種弱陽離子交換柱，其離子交換表面是通過一個胺化的過程得到。

除利用環(huán)氧基團開環(huán)反應的方法，其他的接枝方法也有相應研究。二苯甲酮經(jīng)紫外線照射后，可引發(fā)接枝反應，如Rohr等［35］在聚BMA-co-EDMA聚合物柱表面修飾AMPS，并成功用于分離多肽。Hilder等［36］則把兩層不同功能的多聚物鏈連接，得到新的功能表面。

相對于接枝的方法，把功能化的納米顆粒包被在聚合物的表面的方法較為簡單，也常用于制備功能化聚合物柱。Hilder等［37］在聚BMA-co-EDMA-co-AMPS的表面包被了直徑為60 nm的季銨鹽納米顆粒，制備了陰離子交換柱用于分離多糖。掃描電鏡圖像表明聚合物表面的多孔結構在修飾前后無變化，因而可以證實所修飾納米顆粒的陰離子交換作用。基于類似方法，Hutchinson等［38］和Zakaria等［39］實現(xiàn)了無機陰離子的分離，其洗脫順序表明所修飾的納米顆粒同時具備粒子交換和幫助電泳的機制。

2.3 結合微加工的聚合物整體柱

通過微加工技術可以在芯片微通道內(nèi)形成高度整齊的微結構(collocated monolith support structures，COMOSS)［40］(見圖1)，作為固定相載體，這種微加工整體柱是芯片色譜柱所獨有的。COMOSS的設想最初是由Regnier等［41］提出的，他們首次采用深度反應離子刻蝕技術(Deep Reactive Ion Etching，DRIE)，在微芯片上加工了32條高深寬比的微柱陣列，總寬度為120 μm。在總寬度為1.2 cm的微芯片上，COMOSS總數(shù)超過4×105個。然后在微柱表面上采用靜電法涂覆了聚苯乙烯磺酸，制得了反相電色譜柱。這樣規(guī)整微結構填充的色譜柱，被認為可優(yōu)化獲得接近于理想的流體形態(tài)，以及降低混合(擴散)效應，從而獲得更高的分離效率［42］。He等［43］通過分析卵清蛋白酶解產(chǎn)物的分離效果，對比了C18修飾前后的微加工整體柱，結果表明反相涂層顯著改善了分離效果，且在芯片上的分離速度比常規(guī)的液相色譜梯度洗脫更快。Lavrik等［44］通過優(yōu)化的BOSCH刻蝕工藝，獲得了柱徑0.8～1.6 μm、深寬比25:1的微加工整體柱，其理論塔板數(shù)為1.3×106/m。

硅片基質(zhì)的微加工整體柱價格昂貴，因此有研究者在廉價材料上進行了此類探索。Slentz等［45］發(fā)展了一種微加工整體柱的制備技術，能在廉價的PDMS芯片上制備尺度為10 μm的多組微結構，并在微結構表面鍵合C18硅烷以對異硫氰酸熒光素標記的牛血清白蛋白酶解產(chǎn)物進行電色譜分離，分離多肽的理論塔板數(shù)達到4×105/m。隨后，Slentz［46］等還在 PDMS 柱表面修飾了 2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸等5種聚合物涂層，用于分離BSA的酶解產(chǎn)物，理論塔板數(shù)達6.2×105/m。

碳納米管等納米材料以及氣相沉積法等加工技術，也被利用來制作芯片上的微結構，作為固定相的載體。Fowlkes等［47］將垂直排列的碳納米管原位生長于石英基底，形成微柱結構排列的COMOSS，以增加相比，從而提高分離效率。Mogensen等［48］以乙炔－氨氣作為碳源，采用等離子體增強的化學氣相沉積技術和鎳種子層，在硅芯片通道內(nèi)生長了碳納米管纖維。其表面帶負電荷，產(chǎn)生的電滲流方向與玻璃相同，可將熒光素和5-羧基熒光素分離。Goswami等［49］利用二茂鐵為催化劑，以乙烯為碳源，采用化學氣相沉積方法，在石英微通道內(nèi)得到緊密的纖維狀碳納米管纖維，制備得到了反相色譜柱，并成功分離了硫脲和肽的混合物。

圖1 微加工整體柱的進樣口結構［42］Fig.1 Inlet splitter structure of COMOSS ［42］

3 結論

芯片電色譜應用價值很大，將多種功能整合在微流控芯片上并用于色譜分離，將充分展示微流控芯片的巨大潛力。由于微芯片本身存在尺度限制，微芯片上的開管柱存在分離效率低的缺陷，填充型色譜柱也存在很多問題。相對而言，聚合物整體柱具備諸多優(yōu)點，且其制備過程容易與微芯片相結合，是微芯片色譜柱的一個方向。

原位合成聚合物色譜柱方法最為直接，根據(jù)要求的不同，研究者已經(jīng)開發(fā)了很多的單體材料和制備工藝。對于一般分離需求，這種方式是很好的選擇。采用后修飾的方法在固定相表面連接功能基團可以提高柱分離效果，但這些修飾的反應條件往往不夠溫和，用于PDMS等化學耐受性不夠好的芯片材料時會受到限制。而引入一些微加工技術，就可以在微流控芯片設計時制造出精細的微結構，然后在這些微結構上得到聚合物整體柱，從而充分發(fā)揮微流控芯片微色譜的諸多優(yōu)勢。

［1］MANZ A，GRABER N ，WIDMER H M.Miniaturized total chemical analysis systems:a novel concept for chemical sensing［J］.Sensors and Actuators B:Chemical，1990，1(1/6):244 －248.

［2］何巧紅，方群，方肇倫.微流控電泳分離的試樣引入技術新進展［J］.分析化學，2006，34(05):729－734.

［3］董婭妮，方群.微流控芯片毛細管電泳在蛋白質(zhì)分離分析中的應用研究進展［J］.色譜，2008，26(03):269－273.

［4］程永強，張濤，王鶚，等.激光誘導熒光檢測微流控芯片生化分析儀的研制［J］.分析化學，2008，36(01):127－131.

［5］徐中其，廣川健.基于微芯片電泳的脫氧核糖核酸片段的濃縮和分離［J］.色譜，2009，27(01):102－106.

［6］REGNIER F E，HE B，LIN S，et al.Chromatography and electrophoresis on chips:critical elements of future integrated，microfluidic analytical systems for life science［J］.Trends Biotechnol，1999，17(3):101 － 106.

［7］JACOBSON S C，HERGENRODER R，KOUTNY L B，et al.Open-channel electrochromatography on a microchip［J］.Analytical Chemistry，1994，66(14):2369－2373.

［8］姚波，顏流水，王義明，等.微全分析系統(tǒng)中的電色譜分離技術［J］.分析化學，2004，32(12):1673－1676.

［9］王軍華，黃衛(wèi)華，李靈軍，等.芯片電色譜的最新研究進展及應用［J］.色譜，2010，28(03):264－272.

［10］KUTTER J P，JACOBSON S C，MATSUBARA N，et al.Solvent-programmed microchip open-channel electrochromatography［J］.Anal Chem，1998，70(15):3291－3297.

［11］GASPAR A，PIYASENA M E，GOMEZ F A.Fabrication of fritless chromatographic microchips packed with conventional reversed-phase silica particles［J］.Anal Chem，2007，79(20):7906 －7909.

［12］GASPAR A，HERNANDEZ L，STEVENS S，et al.Electrochromatography in microchips packed with conventional reversed-phase silica particles［J］.Electrophoresis，2008，29(8):1638 －1642.

［13］PARK J，LEE D，KIM W，et al.Fully packed capillary electrochromatographic microchip with self-assembly colloidal silica beads［J］.Anal Chem，2007，79(8):3214 －3219.

［14］平貴臣，袁湘林，張維冰，等.整體柱的制備方法及其應用［J］，分析化學，2001，29(12):1464－1469.

［15］WU R，HU L G，WANG F J，et al.Recent development of monolithic stationary phases with emphasis on microscale chromatographic separation［J］.Journal of Chromatography A，2008，1184(1/2):369 －392.

［16］ZHANG K，GAO R Y，YAN C，et al.Preparation and porous property of C-14-monolithic column for capillary electrochromatography［J］.Chromatographia，2005，61(1/2):55 －60.

［17］BEDAIR M ，Z.EL RASSI.Capillary electrochromatography with monolithic stationary phases-II.Preparation of cationic stearylacrylate monoliths and their electrochromatographic characterization［J］.Journal of Chromatography A，2003，1013(1/2):35 －45.

［18］BISJAK C P，LUBBAD S H，TROJER L，et al.Novel monolithic poly(phenyl acrylate-co-1，4-phenylene diacrylate)capillary columns for biopolymer chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2007，1147(1):46 －52.

［19］LI Y，CHEN Y，XIANG R，et al.Incorporation of single-wall carbon nanotubes into an organic polymer monolithic stationary phase for mu-HPLC and capillary electrochromatography［J］.Anal Chem，2005，77(5):1398 －1406.

［20］LIU J K，CHEN C F，TSAO C W，et al.Polymer microchips integrating solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography using reversed-phase polymethacrylate monoliths［J］.Analytical Chemistry，2009，81(7):2545 －2554.

［21］GU B H，CHEN Z Y，THULIN C D，et al.Efficient polymer monolith for strong cation-exchange capillary liquid chromatography of peptides［J］.Analytical Chemistry，2006，78(11):3509 －3518.

［22］WU R，ZOU H，F(xiàn)U H，et al.Separation of peptides on mixed mode of reversed-phase and ion-exchange capillary electrochromatography with a monolithic column［J］.Electrophoresis，2002，23(9):1239 －1245.

［23］FU H J，XIE C H，XIAO H，et al.Monolithic columns with mixed modes of reversed-phase and anion-exchange stationary phase for capillary electrochromatography［J］.Journal of Chromatography A，2004，1044(1/2):237 －244.

［24］TROJER L，LUBBAD S H，BISJAK C P，et al.Monolithic poly(p-methylstyrene-co-1，2-bis(p-vinylphenyl)ethane)capillary columns as novel styrene stationary phases for biopolymer separation［J］.Journal of Chromatography A，2006，1117(1):56 －66.

［25］YU G E，LUO Q，ZHANG J，et al.Ultratrace LC/MS proteomic analysis using 10-microm-i.d.Porous layer open tubular poly(styrene-divinylbenzene)capillary columns［J］.Anal Chem，2007，79(3):938 －946.

［26］LUO Q，YUE G，VALASKOVIC G A，et al.On-line 1D and 2D porous layer open tubular/LC-ESI-MS using 10-microm-i.d.poly(styrene-divinylbenzene)columns for ultrasensitive proteomic analysis［J］.Anal Chem，2007，79(16):6174 －6181.

［27］VIKLUND C，SJOGREN A，IRGUM K，et al.Chromatographic interactions between proteins and sulfoalkylbetaine-based zwitterionic copolymers in fully aqueous low-salt buffers［J］.Anal Chem，2001，73(3):444 －452.

［28］HOEGGER D，F(xiàn)REITAG R.Investigation of mixed-mode monolithic stationary phases for the analysis of charged amino acids and peptides by capillary electrochromatography［J］.Journal of Chromatography A，2003，1004(1/2):195 －208.

［29］LUO Q Z，ZOU H F，XIAO X Z，et al.Chromatographic separation of proteins on metal immobilized iminodiacetic acid-bound molded monolithic rods of macroporous poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate)［J］.Journal of Chromatography A，2001，926(2):255－264.

［30］LI Y，ZHANG J，XIANG R，et al.Preparation and characterization of alkylated polymethacrylate monolithic columns for micro-HPLC of proteins［J］.J Sep Sci，2004，27(17/18):1467 －1474.

［31］DONG X，DONG J，OU J，et al.Capillary electrochromatography with zwitterionic stationary phase on the lysine-bonded poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate)monolithic capillary column［J］.Electrophoresis，2006，27(12):2518 －2525.

［32］BISJAK C P，BAKRY R，HUCK C W，et al.Amino-functionalized monolithic poly(glycidyl methacrylate-codivinylbenzene)ionexchange stationary phases for the separation of oligonucleoticles［J］.Chromatographia，2005，62(Supple.13):S31 － S36.

［33］WIEDER W，BISJAK C P，HUCK C W，et al.Monolithic poly(glycidyl methacrylate-co-divinylbenzene)capillary columns functionalized to strong anion exchangers for nucleotide and oligonucleotide separation［J］.J Sep Sci，2006，29(16):2478 －2484.

［34］WEI Y，HUANG X，LIU R，et al.Preparation of a monolithic column for weak cation exchange chromatography and its application in the separation of biopolymers［J］.J Sep Sci，2006，29(1):5 －13.

［35］ROHR T，HILDER E F，DONOVAN J J，et al.Photografting and the control of surface chemistry in three-dimensional porous polymer monoliths［J］.Macromolecules，2003，36(5):1677 －1684.

［36］HILDER E F，SVEC F ，F(xiàn)RECHET J M.Shielded stationary phases based on porous polymer monoliths for the capillary electrochromatography of highly basic biomolecules［J］.Anal Chem，2004，76(14):3887 －3892.

［37］HILDER E F，SVEC F ，F(xiàn)RECHET J M J.Latex-functionalized monolithic columns for the separation of carbohydrates by micro anion-exchange chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2004，1053(1/2):101 －106.

［38］HUTCHINSON J P，ZAKARIA P，BOWIE A R，et al.Latex-coated polymeric monolithic ion-exchange stationary phases.1.Anion-exchange capillary electrochromatography and in-line sample preconcentration in capillary electrophoresis［J］.Anal Chem，2005，77(2):407－416.

［39］ZAKARIA P，HUTCHINSON J P，AVDALOVIC N，et al.Latex-coated polymeric monolithic ion-exchange stationary phases.2.Micro-ion chromatography［J］.Anal Chem，2005，77(2):417 －423.

［40］EIJKEL J.Chip-based HPLC:the quest for the perfect column［J］.Lab Chip，2007，7(7):815 －817.

［41］HE B，TAIT N ，REGNIER F.Fabrication of nanocolumns for liquid chromatography［J］.Anal Chem，1998，70(18):3790－3797.

［42］de PRA M，KOK W T，GARDENIERS J G，et al.Experimental study on band dispersion in channels structured with micropillars［J］.Anal Chem，2006，78(18):6519 －6525.

［43］HE B，JI J Y，REGNIER F E.Capillary electrochromatography of peptides in a microfabricated system［J］.Journal of Chromatography A，1999，853(1/2):257－262.

［44］LAVRIK N V，TAYLOR L C，SEPANIAK M J.Enclosed pillar arrays integrated on a fluidic platform for on-chip separations and analysis［J］.Lab Chip，2010，10(8):1086 －1094.

［45］SLENTZ B E，PENNER N A，LUGOWSKA E，et al.Nanoliter capillary electrochromatography columns based on collocated monolithic support structures molded in poly(dimethyl siloxane)［J］.Electrophoresis，2001，22(17):3736 －3743.

［46］SLENTZ B E，PENNER N A，REGNIER F E.Capillary electrochromatography of peptides on microfabricated poly(dimethylsiloxane)chips modified by cerium(IV)-catalyzed polymerization［J］.Journal of Chromatography A，2002，948(1/2):225－233.

［47］FOWLKES J D，HULLANDER E D，F(xiàn)LETCHER B L，et al.Molecular transport in a crowded volume created from vertically aligned carbon nanofibres:a fluorescence recovery after photobleaching study［J］.Nanotechnology，2006，17(22):5659 －5668.

［48］MOGENSEN K B，GANGLOFF L，BOGGILD P，et al.Carbon nanotubes integrated in electrically insulated channels for lab-ona-chip applications［J］.Nanotechnology，2009，20(9):095503.

［49］GOSWAMI S，BAJWA N，ASURI P，et al.Aligned carbon nanotube stationary phases for electrochromatographic chip separations［J］.Chromatographia，2009，69(5/6):473 －480.