某豬場仔豬大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

魯志平，龐 璞，楊曉玲，孫 霖，李云祝，吳顯祥

（四川省大竹縣動物疫病預防控制中心，四川 大竹 635100）

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌（Escherichia coli，簡寫E.coli）某些血清型引起的一種豬腸道傳染性疾病，臨床上分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病。隨著規模化、集約化養豬業的發展，仔豬細菌性腹瀉的發病率越來越高，危害也越來越嚴重。為了掌握四川大竹縣仔豬大腸桿菌病的流行情況，筆者在轄區內某一養豬合作社的豬場采集了疑似仔豬黃、白痢的病料，并進行了病原分離鑒定及藥敏試驗等相關研究，為該豬場制定防控措施提供有益參考。現將有關結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料 選取大竹縣某養豬合作社規模豬場疑似黃、白痢感染的腹瀉仔豬，采用滅菌棉拭子從發病、瀕死或死亡仔豬的直腸取樣，共采集疑似病料20份，由大竹縣動物疫病預防控制中心診斷室保存。

1.1.2 培養基及試劑 普通瓊脂培養基、營養肉湯按文獻制備；麥康凱瓊脂培養基、SS瓊脂培養基、糖發酵管、枸櫞酸鹽、MR試劑、VP試劑、靛基質等試劑，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 血清 E.coli O抗原單價血清，購自中國獸藥監察所。

1.1.4 藥敏片 成套藥敏紙片，含30種抗生素，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離培養 將采集的病料分別劃線接種于普通瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基上，37℃培養18～24h；然后挑取典型的單個菌落分別接種于普通瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、SS瓊脂培養基、營養肉湯培養基進行純菌增殖，觀察菌落形態，再涂片，作革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.2 生化試驗 將純化菌株按腸桿菌科細菌生化鑒定要求分別接種于微量生化管內，37℃培養48～72h，觀察并記錄結果。

1.2.3 分離菌的血清型鑒定 將經形態特征及生化特性鑒定為E.coli的菌株接種于麥康凱培養基上，37℃培養24h；挑取純培養物中的光滑菌落，接種于營養瓊脂斜面，37℃培養24h；用2mL 0.5%的石炭酸生理鹽水洗下瓊脂斜面培養物，置小圓底試管中，制成菌懸液；121℃下高壓滅菌2 h，破壞其莢膜抗原，制成高壓抗原。用E.coli O抗原單價血清進行微量凝集試驗，作血清型鑒定。同時以高壓抗原和0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝現象。

1.2.4 藥敏試驗 將分離鑒定后的E.coli純培養物均勻地涂布于麥康凱瓊脂培養基平板上，無菌條件下用滅菌鑷子將藥敏紙片平貼于培養基表面，要求紙片間距離≥24mm、紙片與培養皿邊緣距離≥15mm，且每種藥物需在不同位置貼2片，37℃倒置培養，分別于16h和24h觀察并記錄結果，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，并計算其平均值。

2 結果與分析

2.1 細菌分離及形態觀察 經過37℃培養24 h后，分離菌純培養物在普通瓊脂培養基上生長為圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明的小凸起菌落；在麥康凱瓊脂培養基上生長為圓形、中等大小紅色菌落，直徑為1～2mm；在SS瓊脂培養基上生長為中等大小、均勻紅色、半透明、圓形、稍凸起的光滑菌落；在肉湯培養基中呈渾濁狀態，管底有灰白色沉淀，液面管壁有菌環，伴有糞臭味。

分離菌經涂片，革蘭氏染色、鏡檢，可觀察到中等大小、無芽胞、單個或多個排列、形態較為一致、兩端鈍圓的革蘭氏陰性球桿菌，疑似E.coli。

2.2 生化鑒定 根據《常見細菌系統鑒定手冊》，該菌的16項生化鑒定結果均與E.coli相符，同時結合病癥、菌落培養特性及菌體特性，確定該分離菌為E.coli。詳見表1。

2.3 血清型鑒定 結果見表2。備檢的E.coli通過定型，分屬于 4 種血清型，優勢血清型為 O20、O101、O141，基本代表了目前該養豬合作社豬場仔豬黃、白痢E.coli的主要流行血清型。

2.4 藥物敏感性試驗 分離E.coli菌株對復達欣（頭孢他啶）、多粘霉素B高度敏感，對氨芐西林、哌拉西林、頭孢呋辛、阿米卡星、新霉素等藥物中度敏感，對其余17種藥物表現為耐藥或高度耐藥。詳見表3。

3 小結與討論

3.1 隨著集約化養豬業的發展，由致病性E.coli引起的仔豬腹瀉嚴重威脅著仔豬的健康，死亡率相對較高，耐過仔豬大多成為“僵豬”，飼料報酬低；并且該病易與其他豬病混合感染，造成仔豬死亡率更高。因此，開展針對性的監測是目前集約化養豬生產中有效防控該病的重要手段。

表1 分離菌的生化鑒定結果

表2 E.coli O抗原血清型鑒定結果

表3 E.coli對30種抗菌藥物的敏感性試驗

3.2 通過對采集的疑似仔豬黃、白痢拭子病料進行病原分離、形態和培養特性觀察及生化鑒定，證實該分離菌為典型的E.coli。說明該場仔豬在出生后所發生的腹瀉主要是由致病性E.coli引起的。

3.3 從本次備檢樣品中分離出的致病性E.coli，有4種血清型，其中血清型O20、O101、O141所占比例較大，表明O20、O101、O141為優勢血清型，代表了目前該養豬合作社豬場中仔豬黃、白痢E.coli的主要流行血清型。從全國各地區報道的血清型來看，各省市流行的豬源致病性E.coli O型血清型有較大差別，存在地區性、多樣性，甚至同一地區的不同豬場，所流行的主要血清型也可能有所不同。此前，四川省其他市、區、縣的規模化豬場中有關致病性E.coli O抗原血清型的鑒定及分布還鮮見報道。因此，定期對豬場的E.coli進行分離鑒定，明確當前流行的血清型，有利于開展針對性的免疫預防和臨床診治。

3.4 由于在養豬生產中濫用抗生素，造成目前E.coli的耐藥譜和耐藥水平不斷提高，而且抗生素在畜體內殘留對人類的健康也會產生不良影響。通過對分離E.coli進行耐藥性試驗，表明該場的E.coli耐藥情況已較為嚴重，而且呈多重耐藥。30種抗生素類藥物中，只對復達欣、多粘霉素B高度敏感，而對氨芐西林、哌拉西林、頭孢呋辛、阿米卡星、新霉素等藥物中度敏感，對其余17種藥物表現為耐藥或高度耐藥。所以在治療過程中，應通過采用有效的藥物和適當劑量來制定合理的治療方案，做到“有的放矢”。

3.5 通過本試驗研究，掌握了大竹縣該養豬合作社仔豬腹瀉的發病情況，并篩選出了有效的治療藥物，為制定科學的飼養管理模式，強化公共環境衛生安全等起到了積極的推動作用，也達到了提高豬場產仔成活率和仔豬育成率的目的。

參與文獻：

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[2] 趙曉靜，高 婕，宋勤葉，等．保定地區仔豬大腸桿菌病的調查與對策分析[J]．中國動物檢疫，2012，29（3）：45-46．

[3] 高月林，解志峰，等．黑龍江省東部地區腹瀉仔豬大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]．養殖技術顧問，2011，（11）：113．

[4] 陳天壽，等．微生物培養基的制造與應用[M]．北京：中國農業出版社，1995：257-260．

[5] 傅彩霞，鄭瑞峰，郭 峰，等．北京部分地區仔豬大腸桿菌病血清型調查[J]．黑龍江畜牧獸醫，2012，（3）：79-80．