羊傳染性膿皰病毒吉林分離株F1L基因的克隆與同源性分析

邵洪澤,程榮華,石春軍,呼延含蓉,黃海楠,許 堯,毛文智,胡桂學

(1. 吉林農業大學 動物科技學院,長春 130118；2. 吉林省畜牧獸醫科學研究院,長春 130062；3. 前郭縣動物疫病預防控制中心,吉林 松原 131100)

羊傳染性膿皰病毒是痘病毒科副痘病毒屬的雙股DNA病毒,主要危害3～6月齡羔羊,易引起急性、 高度接觸性、 嗜皮性的人獸共患病----羊傳染性膿皰病. 該病毒通過直接接觸傳染,在感染動物的口腔、 唇、 舌、 鼻孔周圍、 乳房等部位的皮膚與黏膜形成丘疹、 膿皰、 潰瘍和疣狀痂皮[1]， 常呈群發性流行,如吉林省主要養羊區的發病率為10%～20%,最高為80%,病死率約為10%[2],對人獸健康均構成嚴重威脅[3-4].

羊傳染性膿皰病毒的基因組中部區域(ORFs009-111)較保守,主要包括與病毒在細胞中復制和病毒粒子在細胞漿中裝配成熟的相關基因[5],與痘病毒相關基因的同源性較高,具有較多同源性蛋白質. 其中F1L基因(ORF059)長為1 011 bp,編碼39 000蛋白,該基因位于病毒基因組物理圖譜的中央,是一個完整的開放閱讀框高度保守. 39 000蛋白在病毒成熟過程中作用較大[6]， 是病毒主要的肝素結合蛋白,具有肝素結合活性[7],可與大多數哺乳動物細胞表面表達的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)受體結合,因此該蛋白在病毒吸附和侵入過程中作用較大. 在可溶性肝素存在的條件下,F1L蛋白將與GAGs結合,從而影響病毒吸附宿主,抑制病毒感染[8]. Gallina等[9]研究表明,F1L編碼蛋白能刺激機體中和抗體的產生,并誘導體液與細胞介導的免疫應答. 此外,F1L基因可作為目的基因用于體外重組表達39 000蛋白,為ORFV亞單位疫苗的研制提供標準抗原. 本文選擇表達該蛋白的F1L為目的基因,并研究其同源性,將有利于選擇不同毒株間保守的免疫原基因作為新型疫苗研制的目的基因,為新型疫苗的研制提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 病毒與菌株

羊傳染性膿皰病毒JLSY04株,由吉林省畜牧獸醫科學研究院分離、 凍干保存；E.coli感受態細胞JM109由吉林省畜牧獸醫科學研究院提供， 于-70 ℃保存.

1.2 細 胞

無菌采取健康犢牛睪丸,按文獻[10]方法消化,制作犢牛睪丸細胞.

1.3 試 劑

Mini BEST病毒DNA提取試劑盒購自日本Takara公司；DL2 000 DNA Marker購自北京鼎國生物工程有限公司；2×GC緩沖溶液Ⅰ(加Mg2+)， dNTP 混合液(2.5 mmol)，PfuDNA聚合酶41.675 nkat/μL， pMD18-T載體， 凝膠回收試劑盒， 小量質粒提取試劑盒， 限制性內切酶Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ和MEM購自大連寶生物工程有限公司.

1.4 F1L基因的克隆

1.4.1 病毒的培養 將病毒1MOI接種于生長良好、 已長成單層的牛睪丸細胞內,37 ℃孵育1 h后,用維持液繼續培養,觀察細胞變化. 待細胞病變70%～80%時,收毒,反復凍融3次,-70 ℃保存備用.

1.4.2 病毒DNA的提取及PCR擴增 用Mini BEST病毒DNA 提取試劑盒提取病毒基因組DNA,按照試劑盒說明書操作. 用分光光度計檢測提取的病毒基因組DNA,-70 ℃保存備用.

1.5 F1L基因的序列測定

使用凝膠回收試劑盒回收目的片段,由于PfuDNA聚合酶擴增的PCR產物為平端,因此要將純化后的PCR產物加poly A尾才能連接到T載體. 取1～7 μL純化的PCR產物,加10×TaqDNA聚合酶緩沖液(含有MgCl2)1 μL,終濃度為0.2 mmol/L的dATP,TaqDNA聚合酶1 μL,再加蒸餾水至10 μL,70 ℃反應15～30 min. 取1～2 μL與pMD18-T載體連接,轉化至E.coli感受態細胞JM109中,涂布平板,37 ℃過夜培養. 挑菌,用小量提取質粒試劑盒提取質粒,進行PCR鑒定的同時用Hind Ⅲ和EcoRⅠ進行酶切鑒定,隨機挑選2個鑒定正確的菌由大連寶生物工程有限公司測序.

1.6 序列分析

用DNAstar軟件將所測序列與GenBank中具代表性的相應片段序列進行同源性比較(表1),得到系統進化樹,并比較核苷酸和氨基酸的同源性.

表1 病毒毒株序列比較Table 1 Strain names of the viruses

2 結 果

2.1 細胞病變(CPE)

單層牛睪丸細胞接種病毒18～24 h后變圓、 腫脹,細胞間質增寬,松散并開始聚集,呈葡萄串狀,如圖1所示. 由圖1可見,接種病毒約24 h后呈現明顯的細胞病變.

(A) 正常牛睪丸細胞 (B) 呈葡萄狀細胞病變圖1 病毒在ST細胞上形成CPEFig.1 CPE formation of virus on the ST cells

2.2 病毒DNA提取及PCR擴增結果

采用分光光度計測得樣品羊傳染性膿皰病毒基因組DNA的質量濃度為50 μg/mL. 以提取的羊傳染性膿皰病毒JLSY04株基因組DNA為模板,進行PCR擴增反應,擴增的目的片段約為1 000 bp,與預期片段長度相符,如圖2所示.

2.3 陽性質粒鑒定結果

將連接pMD18-T載體的陽性質粒分別用PCR擴增鑒定,同時用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ進行酶切鑒定,均得到約1 000 bp的目的片段,與預期片段長度相符,結果分別如圖3和圖4所示.

2.4 序列測定結果及同源性分析

所得序列如下：ATGGATCCACCCGAAATCACGGCCTACATAATCGGGGTTGCCGAAGGCCGCGGGACCAAGGAGGTGTTCCCCACGCTGCCGTACCTGGTGGGCCTCGCCGACGACCCGCCCAAGCCTCAACCCGCACCTAAGCCTGCTCCCTCTCCTGCGCCGGCCCCCGCACCGGCCCCCGCGCCAGCACCCAAGCCATCTCCTCCCGCGCCGCACCCCAAGGGCGACCACGTGCTCAAGGCGGTGGAATGGAAAGACGTTGACTCCAAAGACTACCCGCACTTCTTCACGGACATGTGCAAGTCCACGTGTCCGAAGGAGATGCAGCGCCGCGCGGCACACCACCTCAACCTCTGGGAGAGCATATCGGCCGGCACCGTCTCCACCAAGTACTCCGACGATGACTTCGTCCTGGTGGTCGACAACGACATGACCTTCCGCAAGCCCGAGATGGTAAAGCCGCTCATCGAGGCGATGAGGACGAACGGCTGGTACATGGCGCAGCTCAAGGAGACCTACATGACCGGCGCGCTGGCCACCAACGTCCCCGGCACCGGCGACCCCGAGCTCATGGTCTACCCCGGCGGGTACGACGTCTCGCTAGACGCCTACATCATCAACGTCGGCGGCATGAAGAAGCTCTACGACGCGATCATCAAGGAGGGAGGGCTGCGCAGCGGCCTGCTCACCGAGGTGTTCACGCTGGAGAAGCGGCTCTCTCTGGCGCGCGTGGTGCTCTCCGGCGCCGAGCAGGTGGTCTACCCCGAGTACTACATACAGGTGAAGACGCGGCTAAGCGGCGCGCCCTCCCTGTGGTCGCTGCTCGCCACGTGGCTGGCGCGCTTCTGGCCCGGCGCCATCTACTTCCTCACCACGCCGCTCTTCTCCTTCATGGGGCTCTTCGACGTGGACGTGGTCGACATCTTCATCCTGGCATACCTGCTGGTGCTCGTGCTGCTGCTGCCGAACTCGCGGCTGCTGTGGTTCATCGCCGGGCTGCTGGTCACGGCCATCGTGTGA.

M: Marker DL2 000;1: F1L基因PCR擴增產物;2: 陰性對照.圖2 F1L基因PCR擴增產物電泳結果Fig.2 Electrophoresis of F1L amplified products

M: Marker DL2 000;1: F1LPCR擴增產物;2: 陰性對照.圖3 陽性質粒PCR鑒定電泳結果Fig.3 Electrophoresis of F1L amplified products

M: Marker DL2 000;1: Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ酶切鑒定;M2: Marker DL 15 000.圖4 陽性質粒的酶切鑒定結果Fig.4 Identication of the positive plasmid

圖5 F1L基因核苷酸序列同源性比較Fig.5 Phylogenetic tree of F1L from ORFV

測序結果表明,鑒定正確的兩個質粒序列完全相同,結果正確. 將所得羊傳染性膿皰病毒JLSY04株F1L基因的測序序列與GenBank中相應核苷酸序列進行同源性比較,結果如圖5所示. 其中OV/7,OV/20,OV/C2為綿羊分離毒；OV/mi-90,OV/Torino為小羚羊分離毒株；NZ2作為標準毒株. 結果表明,JLSY04分離株與Jilin株的親緣關系最近,與OV/Torino株的親緣關系最遠.

利用DNAstar軟件對8個毒株相應的F1L基因片段進行核苷酸和氨基酸同源性分析,結果分別如圖6和圖7所示.

1～8分別為JLSY04,Jilin,NZ2,OV/7,OV/20,OV/C2,OV/mi-90,OV/Torino.圖6 F1L基因的核苷酸序列同源性分析Fig.6 Nucleic acids sequence analysis of F1L from ORFV

1～8分別為JLSY04,Jilin,NZ2,OV/7,OV/20,OV/C2,OV/mi-90,OV/Torino.圖7 F1L基因的氨基酸同源性分析Fig.7 Amino acid homology analysis of F1L from ORFV

序列分析結果表明,JLSY04分離株的F1L基因片段與Jilin株同源性最高,為99.8%,與NZ2株同源性最低,為97.4%.

3 討 論

3.1 基因克隆DNA聚合酶的選擇

本文PCR擴增使用的PfuDNA聚合酶具有3′-5′的外切酶活性,能糾正DNA擴增過程中產生的錯誤.Pfu是目前已發現的所有耐高溫DNA聚合酶中出錯率最低的聚合酶,熱穩定性較好. 利用PfuDNA聚合酶對羊傳染性膿皰病毒JLSY04株病毒DNA進行擴增,并對鑒定正確的隨機2個質粒進行測序,由序列完全相同可見,該酶的重復性好,擴增效率高,錯賠率低,較穩定.PfuDNA聚合酶擴增的PCR產物為平端,可通過酶切連接其他載體,若連接T載體,則需加poly A尾.

3.2 序列分析及同源性比較

本文將羊傳染性膿皰病毒JLSY04株F1L基因片段的核苷酸序列與已報道的羊傳染性膿皰病毒毒株相應片段核苷酸序列進行了比較,由進化樹可見,從不同宿主和不同地區分離的毒株在遺傳進化上的差異較小,這是由于種間和地區差異所致. 同源性比較結果表明,JLSY04株與Jilin株同源性最高,為99.4%,與OV/Torino株的同源性最低,為96.0%,即F1L基因在不同感染動物分離病毒株間的差異較小. 由于F1L基因編碼的39 000蛋白高度保守,因此,羊傳染性膿皰病毒吉林株JLSY04F1L基因可作為基因工程疫苗的目的基因.

綜上,本文對羊傳染性膿皰病毒JLSY04株的F1L基因片段進行了核苷酸序列測定,并與多株參考毒株進行了同源性比較和分析,為進一步對該病毒的基礎研究和疫苗應用提供了理論和實驗依據.

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