磷酸三酯酶的同源模建及分子對接理論

鄭文琦,趙 麗,宋亞偉,韓葳葳

(1. 吉林建筑工程學院 基礎科學部,長春 130118；2. 吉林大學 分子酶學工程教育部重點實驗室,長春 130012)

有機磷農藥是一種廣泛使用的高效殺蟲劑,但其嚴重污染土壤和地下水,導致生物物種減少和滅絕,破壞生態平衡. 而且大多數有機磷農藥為神經毒素,對人等非靶標生物會產生直接或間接的毒性效應[1-2]. 目前,微生物降解是清理有機磷農藥殘余最安全高效的方法. 磷酸三酯酶樣內酯酶(phosphotriesterase-like lactonases,PLLs)是降解有機磷毒劑最主要的酶類,具有降解磷酸三酯和內酯的雙重功能[3],文獻[4]報道了其降解活力,文獻[5-6]將其定義為一個新的酶類. 但大多數PLLs磷酸三酯酶活力較低. 本文以來源于Thermaerobactermarianensis的磷酸三酯酶為研究對象[7],利用同源模建和分子動力學模擬方法建立蛋白三維結構,通過與磷酸三酯底物和內酯底物對接的研究,確定了形成復合物起重要作用的氨基酸殘基.

1 實 驗

1.1 理論方法 同源模建采用3D-JIGSAW服務器. 來源于Thermaerobacterm的磷酸三酯酶包含331個殘基(NCBI Reference Sequence: YP_004102636.1 EC 3.1.1.8),通過3D-JIGSAW建模建立其三維結構. 先利用Amber全原子力場和GROMACS4.3.1軟件對其進行分子動力學優化[8],再經過7 ns 分子動力學模擬優化其結構.

1.2 分子對接 先在已知晶體結構的磷酸三酯酶樣內酯酶中找到包含配體結構N-丁酰基-DL-高絲氨酸內酯(PDB code 3ojg),再根據配體在活性中心的位置設定中心坐標,將TsPLLs和3ojg的坐標重疊,使用已設定的中心坐標和BOX,利用Autodock軟件對不同的底物進行對接,并根據配體的不同構象、 方向及位置進行評分和排序后,使用CDOKER軟件對最適底物進行柔性對接,以研究酶與底物結合時的重要殘基. 金屬離子采用Zn2+.

2 結果與討論

通過NCBI的BLAST搜索可知,TmPLLs同源性最高(61%)來源于Geobacillus Stearothermophilus Strain 10的有機磷水解酶(PDB code 3F4D[9]),其序列對比如圖1所示.

圖1 TmPLLs的序列對比Fig.1 Sequence alignment of TmPLLs

圖2 TmPLLs的RMSDFig.2 RMSD of TmPLLs

TmPLLs結構由3D-JIGSAW軟件在線構建,構建的結構包含331個殘基. 圖2為TmPLLs通過Gromacs 軟件包進行7 ns分子動力學模擬的均方根偏差(RMSD). 由圖2可見,經過5 ns的動力學模擬,酶的體系已經穩定,RMSD約為0.17.

利用Profile-3D評估優化后的結構,其分值為136.09,接近最高得分150.74,遠高于最低得分67.83. 使用MolProbity[10]評估二面角,其91.5%殘基的二面角在允許范圍內. 因此,TmPLLs的結構可靠.

磷酸三酯酶樣內酯酶具有磷酸三酯酶和內酯酶的雙重功能[9]. 為驗證TmPLLs的底物選擇性,本文進行分子對接研究， 先根據已知帶有配體的結構(PDB code 30jg)設置BOX . 表1為磷酸三酯酶樣內酯酶和N-丁酰基-DL-高絲氨酸內酯的對接能量得分. 由表1可見,BOX設置為44最合適.

表1 磷酸三酯酶樣內酯酶和N-丁酰基-DL-高絲氨酸內酯的對接能量得分Table 1 Docking score between TmPLLs and N-butyryl-DL-homoserine lactone

將TsPLLs和3ojg的坐標重疊,在已經設定的中心坐標和BOX(44)上分別使用3種磷酸三酯底物(乙基對氧磷,甲基對氧磷和內吸磷-S)和3種內酯底物(γ-壬內酯,δ-十一內酯和N-高絲氨酸內酯),通過Autodock 4.2軟件進行分子對接研究,結果列于表2. 由表2可見：3種磷酸三酯底物中,乙基對氧磷和酶的結合自由能最低;3種內酯底物中,γ-壬內酯和酶的結合自由能最低.

表2 結合自由能的計算結果Table 2 Free binding energies calculated

為進一步確定磷酸三酯底物和內酯底物活性位點的重要氨基酸殘基,使用CDOCKER軟件對乙基對氧磷和γ-壬內酯柔性對接,活性位點殘基用文獻[9]報道的Phe28,Cys74,Tyr99,Tyr100,Val268，Trp271,Arg230,Ile233,Phe236，Val237,Trp289.

圖3為γ-壬內酯與酶結合時的重要氨基酸殘基,包括Phe28,His25,Arg44,Arg76,His34,Ile233,Arg230,Phe236,Ser235,Asp266,Trp289,Ser267,Asn269,Val268. 其中Arg44和His25與底物形成的氫鍵如圖4所示. Phe28,Arg230和Phe236是活性點的重要氨基酸殘基,與文獻[10]結果一致.

圖3 γ-壬內酯與酶結合的氨基酸殘基Fig.3 Active residues of TmPLLs-γ-nonanoic lactone complex

圖4 γ-壬內酯與His25,Arg44形成的氫鍵Fig.4 Hydrogen bonds between γ-nonanoic lactone and His25,Arg44

圖5為乙基對氧磷與酶結合時的重要氨基酸殘基,包括His25,Phe28,His34,Arg44,Gly102,His178,Arg230,Ile233,Phe236,Val268,Asp266,Asn269,Trp289. 其中Arg44,Arg230和底物形成2個氫鍵,如圖6所示. 由圖3～圖6可見,Arg44是底物(磷酸三酯和內酯)與酶結合時的重要氨基酸殘基,這是因為Arg44與不同的底物均可形成氫鍵,而氫鍵在酶催化活動中的作用較大,可使復合物的體系穩定,為定點突變實驗提供可靠線索.

圖5 乙基對氧磷與酶結合的氨基酸殘基Fig.5 Active residues of ethyl paraoxon-TmPLLs

圖6 乙基對氧磷與Arg230,Arg44形成的氫鍵Fig.6 Hydrogen bonds between ethyl paraoxon and Arg230,Arg44

底物入口殘基對酶催化活性的變化具有重要作用. 通過文獻[9]和序列對比可知,TsPLLs的入口殘基為Tyr100和Val237. 本文構建出PLLs的Y99W突變體,Tyr99鄰近入口,與野生型的PLLs比較,突變體酶分子的表面靜電勢提高,表明疏水性增強,如圖7所示. 突變體比野生型入口殘基的直徑小,如圖8所示. 由圖8可見,突變體入口殘基V237與Y100的直徑為20.80 nm,野生型入口殘基的直徑為22.21 nm. 通過CASTp軟件分析活性口袋大小: 野生型為874.9 nm3,突變體為917.3 nm3,可見突變體口袋變大. 上述變化均對酶的催化效率產生有益影響,因此Y99W的突變體可提高酶活力.

圖7 野生型PLLs (A)與突變體PLLs (B)的表面靜電勢Fig.7 Protein contact potentials of WT PLLs (A) and PLLs Y99W mutant (B)

圖8 野生型PLLs (A)和突變體 PLLs (B)的入口直徑Fig.8 Diameters of entrance gates of WT PLLs (A) and PLLs Y99W mutant (B)

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