樸麗花，蔡英蘭，張默函，姜京植，金政#，許祖德（.延邊大學組織胚胎學教研室，吉林延吉33000；2.復旦大學附屬華山醫院病理科，上海 200040）

人參皂苷Rh2（Gensenoside Rh2）是從人參中提取的天然活性成分，分子式為C36H62O8H2O，分子質量622，化學名為20（S）-人參二醇-3-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，以往研究已經證實了它能在多個環節上抑制多種腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞凋亡等[1-3]。在對阿霉素（ADM）的前期試驗中也發現人參皂苷Rh2能顯著增強人乳腺癌MCF7/Adr細胞對ADM的敏感性，提高ADM在細胞內的聚積，同時人參皂苷Rh2也能明顯抑制ADM對細胞P-糖蛋白（P-gp）水平的上調，從而證實人參皂苷Rh2確實具有耐藥逆轉作用[4]。近年來研究顯示，磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信號通路參與并促進了腫瘤的侵襲與轉移。聯合治療已成為當今抗腫瘤研究的重要手段[5-6]，兩種藥物協同作用有助于放大較弱的細胞信號。因此，本研究中筆者用PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002聯合人參皂苷Rh2處理MCF7/Adr細胞，以觀察其對乳腺癌細胞侵襲和遷移的影響。

1 材料

1.1 儀器

PROTEAN3型垂直式電泳儀、SD型半干轉印槽（美國Bio-Rad公司）；Avanti30型低溫高速離心機（美國Beckman Coulter公司）；Vmax型酶標儀（美國Molecular Device公司）；TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rh2（上海融禾醫藥科技發展有限公司，純度：＞98%）；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Invitrogen公司）；MTT、鼠抗β-actin單克隆抗體（美國Sigma公司）；基底膜、Transwell室（美國BD公司）；LY294002（美國Alexis Biochemicals公司）；兔抗基質金屬蛋白酶（MMP）2多抗、AKT、磷酸化絲蘇氨酸蛋白激酶（p-AKT）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；鼠抗P-gp單克隆抗體（德國Calbiochem公司）；二抗羊抗兔、羊抗鼠（美國Rockland公司）。

1.3 細胞株

人乳腺癌MCF7/Adr細胞株購自中國科學院上海細胞研究所。

2 方法

2.1 細胞培養

MCF7/Adr細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養箱培養，每2 d更換培養液，0.25%胰蛋白酶消化傳代。選用對數生長期MCF7/Adr細胞，實驗分為四組，即對照（空白培養液）組、人參皂苷Rh2（80 μmol/L）組、LY294002（50 μmol/L）組、人參皂苷Rh2（80 μmol/L）+LY294002（50 μmol/L）組。

2.2 Western blot檢測[7]

當細胞生長融合至30%～40%時，MCF7/Adr細胞的培養液加入不同藥物作用24 h后，細胞裂解液提取細胞總蛋白，定量后取等量樣本行SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉移至PVDF膜上。將膜在封閉液中封閉2 h，分別與P-gp、MMP-2、AKT、p-AKT、β-actin的一抗置4℃孵育過夜。洗膜后再與二抗室溫孵育1 h；TBST室溫洗膜5 min×3次；將膜轉入新鮮配制的化學發光（ECL）孵育液中，室溫孵育5 min；轉入X光暗盒中曝光3 min，顯影，定影。試驗重復3次。

2.3 細胞黏附人工重組基底膜試驗

96孔培養板每孔預鋪基底膜10 μg/50 μl，置超凈臺內風干；培養板用2%牛血清白蛋白（BSA）封阻，置37℃孵育1 h，PBS沖洗并棄去；收集對數生長期的MCF7/Adr細胞，終細胞密度為6×105/ml，每孔加入100 μl，并設DMEM培養基調零孔，37℃培養1 h；棄培養液，以PBS液輕輕沖洗3次除去未黏附細胞；棄去PBS，每孔加入100 μl DMEM 培養基和50 μl MTT，繼續培養4 h。棄去MTT，每孔加入150 μl DMSO溶解，搖振15 min，在570 nm波長處測定其吸光度（OD）。每組平行設3個孔，試驗重復3次。抑制率（%）＝（1－用藥組黏附細胞OD均值）/對照組黏附細胞OD均值×100%。

2.4 細胞體外侵襲試驗[8]

MCF7/Adr細胞接種于覆蓋基底膜的Transwell室的上室，用含0.5%胎牛血清的DMEM培養基培養，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基；48 h后棄培液，用棉簽輕柔拭去膜上細胞，經HE染色后在倒置顯微鏡下計數。

2.5 細胞體外遷移試驗

除Transwell室底部膜的內表面上未鋪基底膜，其余操作同“2.4”項下方法。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 Western blot檢測P-gp、MMP-2、AKT、p-AKT蛋白的表達

與對照組比較，人參皂苷Rh2組、LY294002組、人參皂苷Rh2+LY294002組AKT蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），人參皂苷Rh2組、LY294002 組、人參皂苷Rh2+LY294002組P-gp、MMP-2、p-AKT蛋白表達顯著減弱（P＜0.05）；與人參皂苷Rh2組、LY294002組比較，人參皂苷Rh2+LY294002組AKT蛋白表達顯著減弱（P＜0.05）。P-gp、MMP-2、AKT、p-AKT蛋白的表達見圖1。

圖1 P-gp、MMP-2、AKT、p-AKT蛋白的表達1.對照組；2.人參皂苷 Rh2組；3.LY294002 組；4.人參皂苷 Rh2+LY294002組Fig 1 Expression of P-gp，MMP-2，AKT and p-AKT1.control group；2.gensenoside Rh2group；3.LY294002 group；4.gensenoside Rh2+LY294002 group

3.2 人參皂苷Rh2、LY294002、人參皂苷Rh2+LY294002對MCF7/Adr細胞黏附的影響

與對照組比較，人參皂苷Rh2組、LY294002組、人參皂苷Rh2+LY294002組細胞對基質的黏附力能力顯著降低（P＜0.05）。MCF7/Adr細胞黏附試驗結果見表1（黏附抑制率越高表明其黏附力越小）。

表1 MCF7/Adr細胞黏附試驗結果（±s，n＝6）Tab 1 Results of tests for cell-ground substance adhesion test of MCF7/Adr cell（s±s，n＝6）

表1 MCF7/Adr細胞黏附試驗結果（±s，n＝6）Tab 1 Results of tests for cell-ground substance adhesion test of MCF7/Adr cell（s±s，n＝6）

與對照組比較：＊P＜0.05vs.control group：＊P＜0.05

組別對照組人參皂苷Rh2組LY294002組人參皂苷Rh2+LY294002組濃度，μmol/L 黏附抑制率，%17.5＊18.7＊43.7＊805080+50黏附細胞OD值74.51±3.6561.42±4.46＊60.68±2.37＊42.17±3.82＊

3.3 人參皂苷Rh2、LY294002、人參皂苷Rh2+LY294002對MCF7/Adr細胞侵襲的影響

與對照組比較，人參皂苷Rh2組、LY294002組、LY294002+Rh2組穿過微孔濾膜的細胞數顯著減少（P＜0.05）；與人參皂苷Rh2組、LY294002組比較，人參皂苷Rh2+LY294002組穿過微孔濾膜的細胞數顯著減少（P＜0.05）。MCF7/Adr細胞侵襲試驗結果見表2（過膜細胞數越少表明遷移能力越弱）。

3.4 人參皂苷Rh2、LY294002、人參皂苷Rh2+LY294002對MCF7/Adr細胞遷移的影響

與對照組比較，人參皂苷Rh2組、LY294002組、人參皂苷Rgh2+LY294002組穿過未鋪基底膜微孔濾膜的細胞數顯著減少（P＜0.05）；與人參皂苷Rh2組、LY294002組比較，人參皂苷Rgh2+LY294002組穿未鋪基底膜微孔濾膜的細胞數顯著減少（P＜0.05）。MCF7/Adr細胞遷移試驗結果見表2（過濾細胞數越少表明侵襲能力越弱）。

表2 MCF7/Adr細胞侵襲和遷移試驗結果（±s，n＝6）Tab 2 Results of invasion and metastasis tests of MCF7/Adr cell（s±s，n＝6）

表2 MCF7/Adr細胞侵襲和遷移試驗結果（±s，n＝6）Tab 2 Results of invasion and metastasis tests of MCF7/Adr cell（s±s，n＝6）

與對照組比較：＊P＜0.05；與人參皂苷Rh2組或LY294002組比較：#P＜0.05vs.control group：＊P＜0.05；vs.grensenoside Rh2group or LY 294002 group：#P＜0.05

組別對照組人參皂苷Rh2組LY294002組人參皂苷Rh2+LY294002組遷移試驗65.14±3.3847.31±6.21＊45.47±4.55＊36.21±8.51＊#濃度，μmol/L 805080+50穿膜細胞數侵襲試驗60.26±5.3644.31±3.65＊34.47±5.46＊27.84±7.24＊#

4 討論

近年來，乳腺癌的發病率逐年上升，嚴重威脅著女性的健康，病死率居世界癌癥的第2位[9]。化療是治療惡性腫瘤的傳統方法，但腫瘤的多藥耐藥與復發轉移是導致患者預后不良的重要原因之一。克服腫瘤細胞的耐藥性，抑制轉移是目前臨床上亟需解決的問題。傳統中草藥提取的單體或有效成分，既保持有其天然溫和的特性，又減輕了毒副作用，具有很大的優勢[10-11]。

臨床研究發現，乳腺癌的耐藥和轉移之間存在一定相關性[12]，P-gp的高表達除了與多藥耐藥相關外，還與腫瘤的侵襲轉移密切相關。研究發現，P-gp表達的增加，同時伴有MMP-2表達的增加。PI3K/AKT介導的信號通路是細胞內重要的信號轉導通路，在多種腫瘤組織及細胞中PI3K/AKT信號通路參與調控P-gp與MMP-2的表達，從而調控腫瘤的多藥耐藥和侵襲轉移[13-16]。此外，PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002或Wortmanin則可以抑制腫瘤細胞的轉移[17]。本研究中筆者發現，經LY294002、Rh2、人參皂苷Rh2+LY294002處理模型MCF7/Adr細胞后，P-gp、MMP-2、p-AKT 蛋白表達減弱，人參皂苷Rh2+LY294002組與人參皂苷Rh2組、LY294002組比較上述指標差異具有統計學意義（P＜0.05）。推測PI3K/AKT信號通路可能是通過調控P-gp與MMP-2的表達從而調節腫瘤的多藥耐藥和侵襲遷移。在腫瘤的臨床治療中，聯合應用能靶向抑制PI3K/AKT通路的藥物可能會有效抑制腫瘤的侵襲轉移。

腫瘤細胞侵襲或遷移過程中的關鍵步驟是穿過基底膜，這個過程包括通過細胞的表面受體黏附到基底膜上，分泌多種酶降解鄰近的基底膜組織，在化學趨化物的作用下穿透移動到目標組織。本研究證實了人參皂苷Rh2對MCF7/Adr細胞的侵襲和遷移有明顯的抑制作用，經人參皂苷Rh2和LY294002處理的細胞黏附力、侵襲力和遷移力明顯降低，進而抑制了乳腺癌細胞的侵襲和遷移。

綜上所述，本研究證明抑制PI3K/AKT信號通路可有效降低MCF7/Adr侵襲、遷移能力，PI3K/AKT通路是調控乳腺癌侵襲、遷移的重要信號通路之一。

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