GST-HDAC4融合蛋白載體的構建及其蛋白表達

邵陽光，劉姣，李豐

（中國醫科大學基礎醫學院細胞生物學教研室，教育部醫學細胞生物學重點實驗室，沈陽110001）

組蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases，HDACs）是真核細胞中的一類重要蛋白酶，參與染色質的結構修飾和基因表達調控，在腫瘤的發生和發展中起重要作用［1］。通過組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitors，HDACis） 抑制 HDACs 的作用可使癌細胞凋亡，腫瘤生長狀態改變［2］。目前，HDACs已經成為癌癥治療的靶點［3］。人HDACs分為3類：I類與酵母Rpd3同源，包括HDAC1-3、8、11；Ⅱ類與酵母 Hdal同源，包括 HDAC4-7、9、10；Ⅲ類與酵母Sir2同源，包括SIRT1-7。HDAC4可在核質之間穿梭，與多種蛋白相互作用，參與結腸癌、乳腺癌等癌癥的發生［4，5］、神經元的存亡［6］，且與神經系統退行性疾病密切相關［7］，然而其確切作用機制尚未明確。本研究利用基因重組技術成功構建人HDAC4的原核表達載體，并對其進行誘導表達、純化和鑒定，為進一步研究HDAC4的蛋白質相互作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

大腸桿菌DH5α感受態和BL21感受態為本實驗室制備；pGEX-5X-1購自 Invitrogen公司。人pcDNA3.1-HDAC4質粒由美國佛羅里達H.Lee莫菲特癌癥研究中心E.Seto博士惠贈。

1.2 主要試劑

凝膠回收試劑盒購自Axygen公司，限制性內切酶、DNA分子量標準購自TaKaRa公司，去磷酸化酶及T4 DNA連接酶購自NEB公司，ECL發光試劑盒購自Pharmacia公司，蛋白分子量標準購自MBI公司，異丙基硫代-β-D 半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）購自 Amresco公司，anti-GST 抗體購自Cell Signaling公司，Glutathione Sepharose 4B購自GE Healthcare，其他試劑為國產分析純。

1.3 pGEX-5X-1-HDAC4原核表達載體的構建

pcDNA3.1-HDAC4經EcoRⅠ單酶切后，凝膠回收純化獲得HDAC4產物。EcoRⅠ單酶切pGEX-5X-1載體，凝膠回收后去磷酸化，再回收。將純化后的載體和片段用T4 DNA連接酶16℃過夜連接后，轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，37℃培養過夜。挑取單菌落于LB（Amp）中37℃震蕩培養過夜，提取質粒，EcoRⅠ酶切鑒定片段的插入，SalⅠ酶切鑒定插入的方向。選擇正確插入的克隆送金斯瑞公司測序。

1.4 GST-HDAC4誘導表達及純化

pGEX-5X-1和pGEX-5X-1-HDAC4質粒轉化E.coliBL21后，于1 mL的LB（Amp）37℃震蕩培養過夜，按1︰100稀釋菌液，37℃擴培至OD600為0.6時，不同濃度的IPTG28℃誘導培養4 h。4℃離心收集菌體沉淀，裂解后進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色觀察。將過夜培養的BL21按1︰1000稀釋擴培，IPTG28℃誘導培養4 h。離心收集菌體并裂解后，加入30 μL50%的 Glutathione Sepharose 4B，4℃孵育3 h，用NP-40緩沖液清洗后加入50 μL50%的Glutathione Sepharose 4B，取10 μL 進行 SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色觀察。

1.5 Western blot鑒定GST-HDAC4融合蛋白的表達

將上述誘導表達后的蛋白進行8%SDS-PAGE，電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，anti-GST抗體（Cell Signaling公司，1︰1000）4℃孵育過夜，TBST洗膜15 min、3次后，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（1︰5000）室溫孵育2 h，TBST洗膜15 min、3次，ECL 顯影。

2 結果

2.1 pGEX-5X-1-HDAC4原核表達載體的構建和鑒定

將重組質粒pGEX-5X-1-HDAC4經EcoRI單酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察到3260 bp的插入片段（圖1）。為了鑒定所插入HDAC4全長的方向，將重組質粒經SalⅠ酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，結果獲得7560 bp和664 bp2條帶的為反向，獲得5 636 bp和2588 bp2條帶的為正向，只有1條4 900 bp帶的為載體的自身環化（圖2）。正向陽性重組子測序鑒定正確，無移碼突變。

2.2 GST-HDAC4的誘導表達及蛋白純化

pGEX-5X-1及pGEX-5X-1-HDAC4轉化BL21后IPTG誘導表達，提取蛋白進行SDS-PAGE后考馬斯亮藍染色觀察誘導條帶，與未誘導組相比，重組質粒在146 kDa的位置上出現1條明顯的特異性蛋白帶（圖3）。將已純化好的融合蛋白進行SDS-PAGE后經考馬斯亮藍染色觀察，結果如圖4所示，空心五角星表示融合蛋白的條帶。

2.3 融合蛋白的Western blot鑒定

用anti-GST抗體對GST-HDAC4融合蛋白的表達進行Western blot鑒定。結果顯示：在分子量為120 kDa上方出現1個特異性條帶（圖5），分子量約為146 kDa，為質粒本身的GST分子量（26 kDa）和HDAC4分子量（120 kDa）之和，說明表達了融合蛋白，與預期結果一致。

3 討論

核小體是真核生物染色質的基本結構單位，組蛋白是核小體的重要組成部分。組蛋白可以發生多種共價修飾，其中乙酰化是最早被發現且與轉錄調控有關的組蛋白修飾方式。它是一種可逆的動態過程，由組蛋白乙酰基轉移酶（histone acetyltransferases，HATs）和HDACs共同調控。HATs使染色質結構松散，促進轉錄；HDACs可使組蛋白去乙酰化，染色質致密卷曲，抑制轉錄。組蛋白乙酰化水平的異常在各種癌癥的發生、發展、增殖和分化中起重要作用，研究HDACs對于進一步了解這些疾病的分子機制也有著重要的提示意義［8，9］。HDAC4是Ⅱ類HDACs成員之一，與Ⅰ類HDACs無論在結構上還是功能上都有很大差異。在結構上，HDAC4除了C端的催化結構域外，還含有1個Ⅱ類特有的N端結構域。功能上，HDAC4能夠在核質之間穿梭是區別于Ⅰ類的最大特征。HDAC4是分化和發育過程中重要的轉錄調節因子，其功能的異常與多種癌癥的發生相關，因此深入研究HDAC4的功能及其調控具有重要意義。本研究成功構建了人HDAC4的原核表達質粒，并對其進行誘導表達、純化和鑒定，為深入研究HDAC4與蛋白質的相互作用及其生物學意義奠定了基礎。

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