豬腎細胞感染豬偽狂犬病毒后的細胞觀察與分析

毛 凝，鄭 敏，黃梅清，陳少鶯

（福建省農科院畜牧獸醫研究所，福建 福州 350003）

流式細胞儀是采用流式細胞術在功能水平上對單個細胞或者其他生物粒子懸液進行定量分析和分選的自動化分析儀器，以獲得其大小、內部結構、蛋白質、DNA、RNA及抗原等物理及化學特性。流式細胞儀具有操作簡單、分析快速精準、重復性好、費用經濟等優點，目前已被廣泛使用于檢測細胞周期、細胞凋亡和免疫效果檢測等方面［1－5］。

豬偽狂犬病毒是皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科的成員，可引起豬繁殖障礙綜合癥、仔豬腦脊髓炎，仔豬出現嘔吐、腹瀉、衰竭而死，成年豬一般表現為隱形感染，生長發育受阻并伴隨呼吸道癥狀。目前，豬偽狂犬病在全世界50多個國家和地區均有報道，已給養殖業帶來巨大的損失?，F在，實驗室常用于診斷豬偽狂犬病毒的方法有ELISA和PCR，均只對豬偽狂犬病毒的感染進行定性和定量分析，對細胞確切的變化缺乏微觀分析，而利用流式細胞儀則可對其進行細胞水平的分析［6－9］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 豬腎細胞 （PK細胞）和豬偽狂犬病毒株，由福建省農科院畜牧獸醫研究所畜禽疾病防控工程技術研究中心提供。

1.1.2 主要試劑、試劑盒 培養基1640、胰酶（GIBCO、0.25%）、小牛血清（?？寺」荆?、PBS（海克隆公司）、RNase A （凱基生物）、碘化丙啶 （凱基生物）；細胞周期試劑盒 （KGA512）、細胞凋亡試劑盒 （KGA107），均有凱基生物提供；流式細胞儀 （BD生物科學）

1.2 試驗方法

1.2.1 豬腎細胞培養和處理 （1）豬腎細胞體外培養。豬腎細胞采用傳統體外培養方法：在含有10%小牛血清的1640培養基中培養，貼壁生長狀態良好、鋪滿培養瓶瓶壁時，用胰酶消化傳代，選擇生長良好的細胞進行試驗。試驗組細胞棄去培養液，換入1%小牛血清的維持液，加入100μL豬偽狂犬病毒，顯微鏡觀察試驗組細胞發生70%肉眼可見病變時，用胰酶進行消化。對照組為未加入豬偽狂犬病毒的細胞組，與試驗組細胞同步消化，各組細胞濃度為5×105mol/L。（2）細胞收集。消化后的細胞平均分為3份，1000r/min離心5 min，棄去上清，PBS （0.01mol/L）重懸，重復2次。

1.2.2 細胞周期檢測 （1）收集的細胞懸液用70%的乙醇固定，4℃保存2h，染色前用PBS（0.01mol/L）洗去固定液； （2）加入100μL RNase A，37℃水浴30min；（3）加入400μL PI染色均勻，4℃避光30min；（4）上機檢測。

1.2.3 細胞凋亡檢測 （1）收集的細胞懸液，2000r/min離心5min； （2）用 PBS （0.01mol/L）洗滌細胞2次 （2000r/min離心5min）； （3）加入500μL Binding Buffer懸浮細胞；（4）加入5 μL Annexin V－FITC混勻后，加入5μL Propidium Iodide，混勻； （5）室溫、避光、反應5～15 min；（6）6h內上機檢測。

2 結果與分析

2.1 豬腎細胞的傳代培養和接毒

加入豬偽狂犬病毒前，豬腎細胞排列緊密，單層鋪滿，細胞呈近圓形 （圖1）；加入豬偽狂犬病毒后48h，顯微鏡觀察出現空斑病變，細胞皺縮、變小，界限模糊 （圖2）。

圖1 正常傳代培養的豬腎細胞

2.2 細胞周期檢測

試驗結果顯示，處理前細胞多處于DNA合成期 （S）（圖3）；處理后的細胞大多處在DNA合成前期 （G1）（圖4）。說明細胞大多被阻滯在細胞分裂的DNA合成前期，而沒有進入細胞分裂間期。

圖2 接毒后48h豬腎細胞出現可見病變

圖3 正常細胞周期圖

圖4 處理后細胞周期圖

2.3 細胞凋亡檢測

試驗顯示，正常細胞出現在左下角，顯示PI和FITC染色雙陰性 （圖5）；處理后的細胞集中在右下角，PI染色陰性而FITC染色陽性，提示細胞處于凋亡后期 （圖6）。

圖5 正常細胞凋亡

圖6 處理后細胞凋亡

3 討論

細胞周期是指連續分裂細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂結束所經歷的整個過程。通過細胞周期，細胞的遺傳物質開始復制并加倍，在分裂結束時平均分配到兩個子細胞中去。細胞周期分為細胞間期和有絲分裂期，細胞間期常劃分為休眠期G0、DNA合成前期G1、DNA合成期S、DNA合成后期G2。本實驗利用細胞內DNA能夠和熒光染料碘化丙啶 （propidine iodide，PI）結合的特性進行檢測，即細胞各個時期的DNA含量不同，其與熒光染料的結合情況也不同，流式細胞儀檢測的熒光強度也不一樣。實驗結果顯示，病毒感染后，細胞大部分停滯在DNA合成前期而沒有繼續進入DNA合成期，即細胞沒有進入正常的細胞周期，進而出現凋亡。

細胞凋亡是細胞在一定的生理或者病理條件下，按照自身的規律，啟動內部機制來結束自己生命的過程，即細胞在基因控制下的程序性死亡，是機體維持自身內穩定的基本生理功能。本研究采用Annexin－FTIC和PI為雙熒光探針，Annexin－FTIC/PI法是流式細胞儀檢測細胞凋亡常用的方法之一。正常細胞膜磷脂的分布是不對稱的，膜內表面含負電的磷脂 （如磷脂酰絲酸，PS），而膜外表面含有占絕大多數的中性磷脂。在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin V是一種分子量為35×103～36×103的Ca2＋依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin V進行熒光素FITC標記即能檢測到細胞早期凋亡。碘化丙啶 （propidine iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，而早期凋亡細胞的細胞膜是完好的對PI有拒染性，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來［10－12］。實驗結果顯示，病毒感染后的細胞在雙參數流式細胞儀的散點圖上，左下象限為正常細胞，即 （FITC–/PI－）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC＋/PI＋）；而右下象限為凋亡細胞，顯現（FITC＋/PI－）。

綜上所述，豬偽狂犬病毒感染豬腎細胞影響了細胞的正常周期，大部分細胞被阻滯在DNA合成前期無法進入下一步程序；細胞進而出現大量的凋亡，既而形成了顯微鏡可見的空斑。

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