藏羚羊與藏綿羊小腸嗜銀細胞的觀測

韓 梅

(青海省藏醫藥研究院藥物研究所，青海 西寧 810003)

藏羚羊俗稱獨角羊，青藏高原土生物種，屬偶蹄目、牛科、藏羚屬，系青藏高原特有物種，主要分布在西藏和青海的大部分以及新疆南緣、四川西北隅和甘南西南的部分地區。它們的棲息高度在3700m～5500m，尤以4500m～5500m的高原無人區比較常見，如高寒草甸、高寒草原和高寒荒漠等環境［1］。藏羚羊是長期在極高海拔生活，在長達7個月左右的牧草枯草期，尤其是冬季，草原經常被大雪覆蓋，導致藏羚羊所能獲取到的食物極其有限但就是在這樣惡劣的環境下，藏羚羊依然頑強的生活，這可能與它的消化和吸收能力有著密切的聯系。據曹俊虎［2］等對藏羚羊冷季干物質的消化效率的實驗研究表明，藏羚羊在枯草期對禾本科牧草上部(含種子)、禾本科莖桿及禾本科牧草、混合牧草干物質的消化率分別為72.56%、65.60%和70.86%，對比趙新全［3］、劉金祥［4］、Merkel［5］等多人在野生藏綿羊、高山草原放牧綿羊、公山羊等反芻動物對干物質的消化率的研究，發現藏羚羊冬季對牧草的消化率比以上研究所測得對干物質的消化率(40% ～64%)相對較高，這表明在嚴酷的生境下，藏羚羊通過對牧草干物質較高的消化率為其生存提供了一定的條件。消化道是脊椎動物體內最大、最復雜的內分泌器官［6］。嗜銀細胞屬于內分泌細胞，其主要分泌5－羥色胺(5－HT)［7］，它具有刺激平滑肌收縮、血管擴張及調節胃腸消化的功能。那么，藏羚羊在高寒低氧、食物匱乏的環境中能夠生存，其消化系統尤其是調節小腸消化功能的嗜銀細胞有何特征呢?為了保護和發展這一世界珍稀物種，本實驗采用組織化學的方法對藏羚羊和生活在同一海拔高度的藏綿羊的小腸嗜銀細胞的分布和數量進行了比較研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的取材和固定

經國家林業局批準(林護批字［2009］194號)，在青海省可可西里自然保護區(海拔4 300 m)捕捉健康藏羚羊和藏綿羊各5只，頸總動脈采血后放血處死，就地迅速解剖，取十二指腸、空腸和回腸中段各2 cm左右快速置入4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH7.4)固定液，搖勻，固定48 h。

1.2 石蠟切片制作

1.2.1 脫水透明包埋:固定好的組織分別依次經過50%酒精24 h→70%酒精24 h→80%酒精18 h→95%酒精18 h→100%酒精6 h→酒精﹕二甲苯1 h→二甲苯I 10～20 min(二甲苯的時間長短不同，組織變透亮為宜)→二甲苯﹕蠟30 min→蠟Ⅰ30 min→蠟Ⅱ30 min。包埋時先預熱鋁板、鋁條、鑷子等工具，先倒蠟后放組織。

1.2.2 切片:制作橫斷面連續切片，每隔10張取1張，片厚 3 μm。

1.3 硝酸銀染色

1.3.1 試劑的配制:(1)1%硝酸銀水溶液:硝酸銀0.1 g，加入10 mL雙蒸水，混合均勻即可。(2)0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液的配制:A液:99% ～100%冰醋酸(比重:1.050～1.054)2.875 mL，加蒸餾水至 250 mL。B 液:醋酸鈉 6.8 g，加蒸餾水至250 mL。A液B液混合即可得0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液。(3)硝酸銀液:取1%硝酸銀水溶液3 mL，0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液的配制10 mL，加雙蒸水至100 mL混勻。(4)還原液:對苯二酚1 g，亞硫酸鈉2.5 g，加水至100 mL。

1.3.2 染色步驟:切片按常規脫蠟、復水，然后放入60℃硝酸銀液4 h，雙蒸水洗2次，放入45℃還原液35 min，蒸流水洗3次洗去多余的染液，放入5%硫代硫酸鈉2 min，雙蒸水洗2次，脫水、透明、中性樹膠封片。

1.4 檢測指標和方法

光鏡下觀察嗜銀細胞的形態分布;嗜銀細胞的計數是每只動物各段小腸分別統計5張切片橫斷面全層的嗜銀細胞數，并用Moditec照相處理軟件，計算單位面積內的嗜銀細胞數。

1.5 統計分析

數據處理采用SPSS.V13.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗。結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 藏羚羊與藏綿羊小腸嗜銀細胞的形態與分布

嗜銀細胞經Grimelins染色后，細胞質被染成棕褐色，細胞核不著色，胞漿內顆粒豐富。細胞形態有梭形、蝌蚪形、圓形和不規則形，主要分布在黏膜層，尤其在靠近黏膜肌的小腸腺上皮之間，絨毛上皮之間和絨毛軸心中也有零星分布。并且藏羚羊嗜銀細胞在回腸最多，十二指腸次之，空腸較少，藏綿羊嗜銀細胞在十二指腸最多，回腸次之，空腸較少。

圖1 藏羚羊(A)和藏綿羊(B)十二指腸的嗜銀細胞(箭頭所示)Grimelins染色40×

2.2 藏羚羊與藏綿羊小腸嗜銀細胞的數量

由下表可知，藏羚羊小腸的嗜銀細胞數少于藏綿羊小腸的嗜銀細胞數(P＞0.05)，其中藏羚羊十二指腸的嗜銀細胞數量比藏綿羊的減少38.38%(P ＜0.05)，而藏羚羊空腸和回腸的嗜銀細胞數比藏綿羊空腸和回腸的多31.76%(P ＞0.05)，12.93%(P ＞0.05)。

同一物種不同腸段的嗜銀細胞數量比較，藏羚羊嗜銀細胞數量在回腸最多，十二指腸次之，空腸最少，其中回腸分別較十二指腸、空腸的多 32.36%(P ＜0.05)、43.11%(P ＜0.05)，十二指腸與空腸間差異不顯著(P ＞0.05)。藏綿羊嗜銀細胞數在十二指腸最多，回腸次之，空腸較少，其中十二脂腸分別較空腸、回腸的多131.22%(P ＜0.05)、38.48%(P ＞0.05)。

表1 藏羚羊和藏綿羊小腸嗜銀細胞的數量 (cells/mm2)

圖2 藏羚羊與藏綿羊小腸嗜銀細胞數量的比較

3 討論

嗜銀細胞是消化道內的一類內分泌細胞，主要分泌5－HT，5－HT能刺激胃腸黏膜分泌，平滑肌收縮和血管擴張，對消化功能有很強的調節功能。5－HT在5－HT受體的介導下刺激初級傳入神經元，然后該神經元與肌間神經叢中與上行、下行中間神經元形成突觸，從而產生局部的興奮和抑制作用。上行性中間神經元通過釋放P物質和乙酰膽堿作用于興奮性運動神經元，引起環行肌收縮;下行性中間神經元通過釋放5－HT、血管活性腸肽、生長抑素、速激肽、一氧化氮、血管活性腸肽等神經遞質作用于抑制性運動神經元而使環行肌松弛。由此形成了胃腸道由近端向遠端的蠕動反射［8］。腸道的運動與其內容物的傳輸密切相關。腸道的蠕動速度快，則對腸內容物的傳輸速度也快，反之則慢。有研究發現［9］，在靜脈內注射5－HT或給予選擇性5－HT再攝取抑制劑后，小腸蠕動增強，推進速度加快，內容物通過回盲部的時間縮短;給予大鼠腹膜內注射5－HT能顯著增強其結腸的推進性運動，使腸內容物由近端向遠端結腸移動，快速至直腸排出，甚至可以導致腹瀉。本實驗的研究結果表明，藏羚羊小腸內嗜銀細胞數量少于藏綿羊，尤其是十二指腸的嗜銀細胞數量顯著少于藏綿羊，較少的嗜銀細胞使得其分泌少量的5－TH，后者所激活的一級神經元數量少，從而導致小腸蠕動較弱，腸道由近端向遠端的推進運動緩慢，這個過程使得藏羚羊所采的食物在小腸特別是在十二指腸的存留時間相對藏綿羊要長，因此其對食物的消化時間要長，消化和吸收的效率更高，這在很大程度上促進了藏羚羊對食物的利用效率。

有關哺乳動物小腸嗜銀細胞的分布形式有2種［10］，第一種:內分泌細胞數量在十二指腸較多，向尾端有降低的趨勢，形成一條從小腸頭端向尾端傾斜的分布密度曲線，如豬、貓、馬、豚鼠;第二種:內分泌細胞在小腸中段數量極少，而在頭尾兩端即十二指腸和回腸數量較多，形成一個“U”形的密度分布曲線，如大鼠。本研究中藏羚羊和藏綿羊小腸嗜銀細胞的分布形式與第二種一致。

［1］Nuss HB，Houser SR.Sodium －calcium exchange－mediated contractions in feline ventricular myocytes［J］.Am J Physiol 1992.2634 P(2):1161 －1169.

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［4］劉金祥，任繼周，胡自治等.高山草原綿羊放牧生態及消化代謝系列研究V放牧綿羊采食量和消化代謝限制性因素的灰色關聯度分析［J］.草業學報，2001.10(1):71－ 77.

［5］Merkel R C ，Toerien C，Sahlu T，Blanche C.Digestibility，N balance and blood metabolite levels inAlpine goat wethers fed either water oak or shining sum ac leaves［J］.Sm all Rum inant Research，2001.123 －127.

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［9］賴俊浩，王俊義，張同樣，等.表皮生長因子對TPN大鼠黏膜機械屏障的響［J］.腸外與腸內營養，1997.4(4):213－215.

［10］李淑蘭，孫慶玲.小鼠胃腸道嗜銀細胞的分布及形態學觀察.生物技術，7(4)，27 －29.1997.