硅溶膠－納米金修飾金電極電化學(xué)發(fā)光法測定苦參堿的研究

羅 應(yīng)，李利軍，鄧春燕，程 昊，孫 科，李彥青

(廣西工學(xué)院 生物與化學(xué)工程系，廣西 柳州 545006)

苦參堿(Matrine，MT，結(jié)構(gòu)式見圖1)是從豆科槐屬植物苦豆子(Sophora alopecuroides L)的干燥根、植株、果實(shí)中提取的一種具有廣泛生物活性的生物堿，具有鎮(zhèn)咳、護(hù)肝、保肝、鎮(zhèn)痛、消炎抗菌、清熱利尿、抗腫瘤、抗過敏、抗心率失常等多種藥理作用［1］。目前，關(guān)于苦參堿的測定方法有高效液相色譜法［2－3］、毛細(xì)管電泳法［4－5］、直接電化學(xué)法［6］、氣相色譜法［7］、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［8］等。但這些方法或操作繁瑣，或涉及有毒試劑，或使用的儀器設(shè)備貴重以及需專業(yè)的技術(shù)人員。與之相比，電化學(xué)發(fā)光法的選擇性好、靈敏度高、操作簡單。因此，研究和建立簡單、快速、靈敏的苦參堿電化學(xué)發(fā)光分析新方法具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖1 苦參堿的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of matrine

傳統(tǒng)的電化學(xué)發(fā)光(ECL)研究僅限于在裸電極/電解液界面上，而電極表面的分子剪裁、微結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)及其潛在應(yīng)用價(jià)值的研究，提高了電化學(xué)發(fā)光的靈敏度，將其應(yīng)用推進(jìn)到一個(gè)新的階段。化學(xué)修飾電極在提高選擇性和靈敏度方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性，修飾電極表面上的微結(jié)構(gòu)可提供多種能利用的勢場，使待測物能夠進(jìn)行有效的分離富集，基于控制電極點(diǎn)位還可進(jìn)一步提高其選擇性［9］。目前，有關(guān)修飾電極的研究已有報(bào)道。郭志慧等［10］用Nafion膜修飾電極，周谷珍等［11］用Self-Assembling(SA)膜法修飾電極，Bard等［12］用Langmuir－Blodget(LB)膜法修飾電極。但這些方法都存在不足之處，如Nafion膜的傳質(zhì)過程較慢［13］，自組裝膜在反復(fù)的電壓掃描時(shí)不穩(wěn)定;LB膜易被有機(jī)溶劑破壞而剝離電極等。本文采用溶膠－凝膠法對電極進(jìn)行了修飾。

硅溶膠是二氧化硅膠體微粒在水中均勻擴(kuò)散形成的乳白色半透明膠體溶液，可形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有較好的生物相容性、物理剛性、化學(xué)惰性、熱穩(wěn)定性及在水中幾乎不溶脹等性質(zhì)［14］。硅溶膠具有成膜溶解的特性，但在成膜時(shí)收縮較大、易龜裂，為克服這個(gè)缺點(diǎn)，可添加水溶性乳液作為輔助成膜物，如聚乙烯醇(PVA)。納米金具有高比表面積、高表面活性及良好的導(dǎo)電性等特性［15］，因其可提高電極與表面修飾物之間的電子傳遞，增加電極表面的反應(yīng)位點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于修飾電極。但將硅溶膠與納米金制成混合液修飾金電極用于聯(lián)吡啶釕體系中的報(bào)道較少。本文將硅溶膠、聚乙烯醇(PVA)、L-半胱氨酸按比例混合制成復(fù)合物溶液，再將納米金與復(fù)合物溶液超聲混合后作為電極修飾材料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此修飾電極對聯(lián)吡啶釕具有很好的電化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光特性。據(jù)此建立了電化學(xué)發(fā)光測定苦參堿的新方法，并將其成功應(yīng)用于藥片中苦參堿含量的測定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁電子科技有限公司);DL－60D型超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);XW－80A型旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司);EF20 pH計(jì)(梅特勒－托利多儀器上海有限公司)。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng):硅溶膠－納米金修飾的金電極作為工作電極，Pt絲電極為對電極，Ag/AgCl(飽和KCl溶液)為參比電極。

1.5×10－4mol/L苦參堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取0.003 7g苦參堿(中國藥品生物制品檢定所)，用水定容于100 mL的棕色容量瓶中，超聲脫氣后冷藏于冰箱中(4℃)備用;1.0×10－3mol/L聯(lián)吡啶釕儲備液:準(zhǔn)確稱取六水合三(2，2-聯(lián)吡啶)氯化釕(購于Aldrich公司)0.018 7 g，用水定容于25 mL的棕色容量瓶中，用超聲波除氣后放入冰箱中(4℃)冷藏;氯金酸(上海科興實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司);檸檬酸三鈉(臺山市粵僑試劑塑料有限公司);PVA4000(廣州化學(xué)試劑廠);L-半胱氨酸(上海晶純試劑有限公司);硅溶膠、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、四硼酸鈉(西隴化工股份有限公司)，所用試劑除苦參堿、聯(lián)吡啶釕為優(yōu)級純外，其它均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為二次石英亞沸水。

1.2 修飾電極的制備

1.2.1 金電極的預(yù)處理 修飾前用金相砂紙小心打磨金絲電極(d=1 mm)，并在鹿皮上用Al2O3粉(d50=20～50 nm)拋光至鏡面，用水沖洗后，依次用水、無水乙醇－水(1∶1，體積比)、水超聲清洗，晾干。將其置于0.10 mol/L H2SO4溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安(CV)曲線，晾干待用。

1.2.2 納米金的制備 納米金的制備方法與文獻(xiàn)［16］相似。將氯金酸溶液置于數(shù)顯測速恒溫磁力攪拌器上，在600 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌加熱至沸騰，再加入一定量的檸檬酸三鈉，使液體顏色穩(wěn)定并持續(xù)加熱一段時(shí)間后，停止加熱，冷卻至室溫，得納米金溶膠。

1.2.3 硅溶膠－納米金混合溶液的制備 將0.3 mL硅溶膠、0.15 mL L-半胱氨酸(10 mmol/L)、0.2 mL 0.05%的PVA混合，制成硅溶膠混合溶液，再向其中加入0.2 mL納米金制成硅溶膠－納米金混合溶液。

1.2.4 硅溶膠修飾金電極與硅溶膠－納米金修飾金電極的制備 將經(jīng)過預(yù)處理的金電極浸入0.65 mL硅溶膠混合液中，約30 s后取出，在4℃下放置12 h后得硅溶膠修飾金電極;將經(jīng)過預(yù)處理的金電極浸入0.85 mL硅溶膠－納米金混合液中，約30 s后取出，在4℃下放置12 h后得到硅溶膠－納米金修飾金電極。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，測定發(fā)光強(qiáng)度前溶液用超聲波除氣5 min，所有電位值均相對于參比電極。由MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光工作站分別記錄Ru(bpy發(fā)光強(qiáng)度I0和Ru(bpy與苦參堿的發(fā)光強(qiáng)度I，以相對強(qiáng)度(I－I0)繪制相對峰高強(qiáng)度與苦參堿濃度的校正曲線。工作電極采用硅溶膠－納米金修飾的金電極，支持電解質(zhì)為0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 9.0)，光電倍增管負(fù)高壓為800 V，循環(huán)伏安掃描速率為100 mV/s。電化學(xué)發(fā)光檢測池如圖2所示。

圖2 電化學(xué)發(fā)光檢測示意圖Fig.2 Schematic diagram of the ECL detection cell

2 結(jié)果與討論

2.1 苦參堿在不同電極上的電化學(xué)與電化學(xué)發(fā)光行為

考察了苦參堿在不同電極上的電化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光行為。圖3A為苦參堿在硅溶膠－納米金修飾的金電極(a)、硅溶膠修飾的金電極(b)和裸金電極(c)上的CV圖。由圖3A可以看出，在相同條件下，硅溶膠－納米金修飾金電極比硅溶膠修飾金電極對聯(lián)吡啶釕的增敏效果好，氧化峰電流由8.1 μA增至16.2 μA，增大了2倍。同時(shí)，修飾電極與裸電極相比，充電電流明顯增大，這是因?yàn)楣枞苣z、納米金的加入增加了電極的比表面積和電極表面的反應(yīng)位點(diǎn)。因此，最終采用硅溶膠－納米金修飾的金電極作為工作電極。

由圖3B可以觀察到苦參堿在硅溶膠－納米金修飾的金電極(a)、硅溶膠修飾的金電極(b)和裸金電極(c)上的發(fā)光強(qiáng)度分別為1 549、896和230，硅溶膠－納米金修飾的金電極上的發(fā)光強(qiáng)度大大增加，是裸電極的6.7倍。這表明硅溶膠、納米金的加入增加了電極的比表面積和電極表面的反應(yīng)位點(diǎn)，與圖3A的結(jié)論一致。

圖3 苦參堿在不同電極上的循環(huán)伏安圖(A)和循環(huán)伏安發(fā)光圖(B)Fig.3 CVs(A)and ECL curves(B)of different electrodes in 1.50×10－5mol/L matrine

2.2 苦參堿對Ru(bpy)電化學(xué)與電化學(xué)發(fā)光行為的增敏作用

實(shí)驗(yàn)于0.2～1.25 V的電位范圍，考察了Ru(bpy苦參堿與Ru(bpy共存體系在硅溶膠－納米金修飾金電極上的電化學(xué)行為和電化學(xué)發(fā)光行為(見圖4)。從圖4A的循環(huán)伏安圖可以觀察到Ru(bpy在0.95～1.15 V左右出現(xiàn)一氧化峰(曲線a)，當(dāng)加入苦參堿后，氧化峰電流升高，峰電位仍在0.95～1.15 V左右(曲線b)，該現(xiàn)象表明苦參堿對Ru(bp的電化學(xué)反應(yīng)有明顯的增敏作用。同時(shí)可以觀察到共存體系中僅在1.1 V左右出現(xiàn)1個(gè)特征氧化峰，說明苦參堿和Ru(bpy發(fā)生電化學(xué)共反應(yīng)前并未被氧化，1.1 V處的電流為Ru(bp氧化所致。

從圖4B的電化學(xué)發(fā)光圖觀察到，當(dāng)加入一定濃度的苦參堿時(shí)，Ru(bpyECL強(qiáng)度從380(曲線a)增加到12 582(曲線b)，在1.0 V開始出現(xiàn)發(fā)光信號，到1.1V達(dá)到最大值，這與圖4A中在1.1 V處氧化峰電流達(dá)到最大相符。可見，在相同的條件下，加入苦參堿后，Ru(bpy的發(fā)光強(qiáng)度增加約25倍，說明苦參堿對Ru(bp的ECL強(qiáng)度具有顯著增強(qiáng)作用。

圖4 苦參堿對Ru(bpy循環(huán)伏安圖(A)及電化學(xué)發(fā)光圖(B)的增敏作用Fig.4 CVs(A)and ECL curves(B)of matrine on silica sol－nano-gold modified gold

2.3 緩沖體系以及pH值的選擇

緩沖體系及pH值對生物堿類藥物與Ru(bpy)2+3的反應(yīng)有重要影響。本實(shí)驗(yàn)考察了0.2 mol/L H3BO3－0.05 mol/L Na2B4O7·10H2O緩沖體系和0.1 mol/L Na2HPO4－0.1 mol/L NaH2PO4緩沖體系對聯(lián)吡啶釕－苦參堿體系ECL強(qiáng)度和穩(wěn)定性的影響(見圖5)。結(jié)果表明，PBS緩沖體系的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯優(yōu)于硼酸體系，在酸性環(huán)境或堿性過高的情況下ECL強(qiáng)度較低，在pH 9.0時(shí)達(dá)到最大值，可能是由于溶液中過多的OH－參與電極上的競爭反應(yīng)造成高價(jià)態(tài)聯(lián)吡啶釕(Ⅲ)減少。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選擇pH 9.0的PBS緩沖體系作為最佳介質(zhì)。

圖5 緩沖溶液pH值對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of pH value on ECL intensity

2.4 修飾劑配比的選擇

納米金的濃度不但影響聯(lián)吡啶釕的ECL強(qiáng)度，而且也影響膜的電子傳遞及機(jī)械強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在硅溶膠中不斷增加納米金量的過程中，電極表面的催化活性位點(diǎn)不斷增加，其氧化電流增大，ECL強(qiáng)度也隨之增強(qiáng);但當(dāng)納米金與硅溶膠的體積比超過1∶3時(shí)，過多的納米金易發(fā)生團(tuán)聚而使電極重復(fù)性變差，信噪比降低。因此實(shí)驗(yàn)選擇納米金與硅溶膠的體積比1∶3作為修飾劑的最佳配比。

2.5 儀器參數(shù)的優(yōu)化選擇

光電倍增管負(fù)高壓影響儀器檢測的靈敏度及穩(wěn)定性，考察了不同負(fù)高壓對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明:隨著負(fù)高壓的增大，發(fā)光強(qiáng)度和噪聲均增大，為了得到足夠的靈敏度和較低的噪音，選擇800 V作為本實(shí)驗(yàn)的負(fù)高壓。考察了不同掃描速率(10～100 mV/s)對ECL發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明:隨著掃描速率的增大發(fā)光強(qiáng)度增大，當(dāng)達(dá)到100 mV/s后基本趨于平衡，這可能是由于較大的掃描速率可以保證在電極表面產(chǎn)生足夠的高價(jià)聯(lián)吡啶釕(Ⅲ)，同時(shí)有限的電極表面積使產(chǎn)生的高價(jià)聯(lián)吡啶釕(Ⅲ)的量達(dá)到一定的平衡，因此發(fā)光強(qiáng)度值基本不變，但過高的掃描速率會影響儀器的使用壽命。綜合考慮，選擇100 mV/s作為本實(shí)驗(yàn)的最佳掃描速率。

圖6 不同濃度苦參堿的電致化學(xué)發(fā)光曲線Fig.6 ECL curves of different concentrations of matrine cmatrine(a－ f):0.15，3.0，12.0，30.0，90.0，150.0 μmol/L;insert:calibration curve of ECL intensity vs.matrine concentration

2.6 方法的評價(jià)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，通過電致化學(xué)發(fā)光工作站記錄了不同濃度苦參堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的發(fā)光強(qiáng)度響應(yīng)曲線(圖6A)，以相對峰高對其濃度進(jìn)行線性回歸。苦參堿濃度在1.5×10－7～1.5×10－4mol/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(r2=0.998 4)(圖6B)，其線性回歸方程為:I=81.023×106c+228.26，檢出限(S/N=3)為7.3×10－9mol/L，連續(xù) 8次測定 1.5×10－5mol/L的苦參堿，發(fā)光強(qiáng)度值的RSD為1.4%。

2.7 樣品的分析

取1枚苦參堿栓50 mg(武漢人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)，溶于5 mL 0.1 mol/L鹽酸，過濾后用水定容至200 mL棕色容量瓶中，稀釋后其標(biāo)示濃度為1.00×10－5mol/L，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下對該樣品平行測定5次，其RSD為2.4%，表明此方法的重現(xiàn)性好。

在樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，測得回收率為98%～102%，平均回收率為100%，RSD為1.8%，表明方法具有較好的靈敏度和重現(xiàn)性，可有效用于實(shí)際樣品的分析。

3 結(jié)論

建立了以硅溶膠－納米金修飾的金電極作為工作電極電化學(xué)發(fā)光測定苦參堿的方法，充分利用硅溶膠、納米金的高靈敏電催化作用，提高了電極的電流響應(yīng)，拓展了線性范圍。該修飾電極結(jié)合了硅溶膠和納米金的優(yōu)點(diǎn)，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好和操作簡便等特點(diǎn)，拓寬了聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光體系的應(yīng)用范圍，若將此方法應(yīng)用于傳感器的制備將具有重要意義。

［1］Ren C C，Gao Z N.Chin.J.Anal.Lab.(任超超，高作寧.分析試驗(yàn)室)，2009，28(8):47－50.

［2］Liang Y M.Chem.Ind.Technol.Dev.(梁燕明.化工技術(shù)與開發(fā))，2006，35(7):27－28.

［3］Zhang L，Xu L，Tan X J，Liao Q F，Guo W，Chen X H，Bi K S.Chromatographia，2007，66:115 －120.

［4］Chen Q H，Li P，Cheng F J，Li B，Wu S C，He J.Chromatographia，2009，69:11 －12.

［5］Li L J，Hu D C，Gao W Y，Li Y Q，Kong H X.J.Instrum.Anal.(李利軍，胡大春，高文燕，李彥青，孔紅星.分析測試學(xué)報(bào))，2011，30(6):678－682.

［6］Yao H Q，Gao Z N，Han X X，Yu J Q，Du Y.J.Ningxia Univ.:Nat.Sci.Ed.(姚慧琴，高作寧，韓小霞，余建強(qiáng)，杜鹽.寧夏大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版)，2004，25(4):346－348.

［7］Jiang L，Wang H X.Anal.Instrum.Newslett.(江林，王海霞.分析測試儀器通訊)，1997，7(4):222－227.

［8］Wu Y J，Chen J J，Cheng Y Y.Anal.Bioanal.Chem.，2005，382:1595 －1600.

［9］Dong S J，Che G L，Xie Y W.Chemically Modified Electrodes.Beijing:Science Press(董紹俊，車廣禮，謝遠(yuǎn)武.化學(xué)修飾電極.北京:科學(xué)出版社)，2003:1－10.

［10］Guo Z H，Tang L J，Zhang Z J.Chin.J.Anal.Chem.(郭志慧，唐隆健，章竹君.分析化學(xué))，2009，37(1):13－18.

［11］Zhou G Z，Zheng L Y，Li L H，Sun Y X.J.Hunan Univ.Arts Sci.:Nat.Sci.Ed.(周谷珍，鄭麗英，李莉花，孫元喜.湖南文理學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版)，2008，20(3):38－41.

［12］Zhang X，Bard A.J.Phys.Chem.，1988，92:5566－5569.

［13］Wang H Y，Xu G B，Dong S J.Analyst，2001，126:1095 －1099.

［14］Gao Y S，Wang Y，Di J W.J.Appl.Chem.(高鹽生，王媛，狄俊偉.應(yīng)用化學(xué))，2010，27(3):363－366.

［15］Du Y，Luo X L，Xu J J，Chen H Y.Bioelectrochemistry，2007，70(2):342－347.

［16］Frens G.Nat.Phys.Sci.，1973，241:20 －22.