補腎解毒方與健脾解毒方含藥血漿對慢性乙肝病毒感染不同免疫狀態患者外周血T細胞功能的影響

歐 松，孫克偉，彭建平，祁雙林，聞 杰，胡 莉

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007）

乙型肝炎病毒（HBV）感染后慢性乙型肝炎患者外周血免疫細胞均存在著免疫功能缺陷或低下，其中，以T 淋巴細胞功能低下為中心的細胞免疫功能障礙導致的免疫耐受是HBV 持續感染、慢性乙型肝炎難以治愈的主要原因[1]。既往研究表明中醫藥在改善機體免疫狀態，恢復和提高免疫細胞功能，重建免疫應答具有較好的作用[2-4]。針對HBV 慢性感染其外因是濕熱疫毒內侵，內因歸屬脾、腎二臟虧虛[5]，本研究擬運用HBV 感染免疫耐受期與免疫清除期患者外周血T 細胞體外培養的細胞模型和中藥血漿藥理實驗方法，比較補腎解毒方和健脾解毒方對HBV感染不同免疫狀態患者的外周血T 細胞功能的影響，為臨床提高中醫藥治療慢性乙型肝炎的療效提供指導思路和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級SD大鼠30只，雌雄各半，41 d 齡，（164.2±10.6）g，湖南中醫藥大學動物學部提供，使用許可證號：SCXK (湘)2009-0004。實驗大鼠于2010年9月24日至2010年10月6日在湖南中醫藥大學動物學部SPF 級飼養房喂養。

1.2 藥物

補腎解毒方：六味地黃丸（《小兒藥證直訣·卷下》[6]）加甘露消毒丹（《溫熱經緯》[7]）化裁：熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，白蔻仁10 g，藿香10 g，茵陳15 g，滑石30 g，石菖蒲10 g，黃芩10 g，連翹10 g，川貝母10 g，射干10 g，薄荷6 g；健脾解毒方：四君子湯（《太平惠民和劑局方》[8]）加甘露消毒丹化裁：人參、白術、茯苓、炙甘草各9 g，白蔻仁10 g，藿香10 g，茵陳15 g，滑石30 g，石菖蒲10 g，黃芩10 g，連翹10 g，川貝母10 g，射干10 g，薄荷6 g。飲片均采用道地藥材，由長沙九芝堂股份有限公司提供，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制備，補腎解毒小、中劑量組分別含生藥1.94、9.71 g/mL；健脾解毒小、中劑量組分別含生藥1.58、7.92 g/mL。

1.3 試劑與儀器

BS 緩沖液：天津津脈；淋巴細胞分離液：天津灝洋公司；RPMI1640：吉諾生物醫藥技術有限公司；10%胎牛血清(FCS)：美國Hyclone 公司；1%多聚甲醛:天津市化學試劑研究所；熒光抗體CD3-Percp(多甲藻葉綠素蛋白)，CD4-FITC （異硫氰酸熒光素)，CD8-PE（藻紅蛋白熒光素），CD28-FITC，同型對照IgG2a-Percp，IgG1-FITC，IgG2a-PE，均購自美國ebioscience 公司；水套式CO2培養箱（中國力康發展有限公司）、倒置生物顯微鏡XD-202 型(南京江南永新光學有限公司)、FACS Calibur 流式細胞儀(BD亞洲有限公司)。

1.4 T 細胞分離與培養

選擇36 例湖南中醫藥大學第一附屬醫院感染科2010年6月至2011年5月門診HBV 慢性感染患者，均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[9]診斷標準，均簽署知情同意書。根據免疫狀態分為免疫耐受組和免疫清除組，其中免疫耐受組18 例，男12 例，女6 例，平均年齡（28.5±4.56）歲，病程7～22年，平均病程（11.6±4.6）年；免疫清除組18 例，男11 例，女7例，平均年齡（30.2±2.65）歲，病程8～20年，平均病程（12.8±3.4）年。另選擇10 名湖南中醫藥大學健康學生及湖南中醫藥大學第一附屬醫院健康職工作為健康組，其中男6 例，女4 例，平均年齡（25.7±3.5）歲。各組一般資料比較，差異無統計學意義 （P＞0.05）。運用密度梯度離心法，無菌條件下抽取人外周血20 mL，肝素抗凝（50 u/mL），PBS 對倍(1∶1)稀釋，用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)，PBS 洗滌2次，RPMI1640 洗 滌1 次。再 用RPMI1640 液 懸 浮PBMCs，注入T 細胞尼龍毛柱，37 ℃、5%CO2培養箱孵育4 h，沖洗出非粘附細胞即為自體T 淋巴細胞。最后用含體積分數為10%的胎牛血清RPMI-1640培養基懸浮細胞，調整外周血PBMCs 終濃度為2×106/L 于6 孔培養板內，置37 ℃、5%CO2培養箱進一步培養。

1.5 動物分組及干預方法

SD 大鼠隨機分為5 組：正常對照組(10 只)、補腎解毒小劑量組(5 只，1.94 g/mL)、補腎解毒中劑量組 (5 只，9.71 g/mL)、健脾解毒小劑量組 (5 只，1.58 g/mL)、健脾解毒中劑量組(5 只，7.92 g/mL)。SD大鼠灌胃量按體表面積法換算，小劑量相當于成人臨床用藥量6.562 倍[10]，其5 倍劑量為中劑量。具體灌胃干預措施及大鼠含藥血漿制備均按文獻[11-12]方法進行。正常對照組采用等量生理鹽水灌胃。每天上午8：00、下午5：00 灌胃，每次灌胃量為1 mL，連續3 d，第4 天上午灌胃后1～2 h 內取血。采血前12 h 禁食，自由飲水，1%戊巴比妥腹腔注射麻醉（45 mg/kg），待麻醉滿意后開腹，分離腹主動脈，持采血針刺入腹主動脈，接負壓肝素抗凝管取血，每只大鼠采血約10 mL，2 500 r/min 離心20 min，取血漿，0.22 μm 濾膜濾過除菌，將血漿分裝至1.5 mL EP 管中，置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.6 最佳血漿培養濃度的確定

采用MTT 法收集分離培養成熟的T 細胞，用預熱的RPMI1640 培養液洗滌細胞2 次，用完全培養液配制成單個細胞懸液，以2×105/mL 接種96 孔培養板，每孔100 μL，分別加入含藥血漿5、10、20 μL，使終濃度分別為5%、10%、20%，每一濃度同時設3 個復孔。正常對照組大鼠血漿為正常對照孔，5%CO2、37 ℃飽和濕度孵育48 h。每孔加入20 μL(5 g／L) MTT 溶液，繼續孵育4 h，棄上清液，加入200 μL DMSO 振蕩10 min，在酶標儀上選擇492 nm 波長，以630 nm 波長為參照波長，測定各孔吸光度值(OD 值)。選擇T 細胞生存率最高的血漿濃度作為干預濃度。T 細胞生存率=藥物干預組／正常對照組OD 值×100%。

1.7 含藥血漿干預

于培養第1 天收集DCs 細胞，同以上操作配制2×105/mL 單個細胞懸液。取1 mL T 細胞懸液，用于干預前T 細胞功能檢測。其余T 細胞懸液各取出1／3，分別以最佳血漿培養濃度的藥物血漿進行干預，37 ℃、5%CO2培養箱繼續培養48 h 后進行T 細胞功能檢測。剩余1／3 T 細胞懸液加入等濃度的空白血漿作為空白血漿組。選擇OD 值最高的空白血漿濃度，即添加濃度為20%含藥血漿濃度作為計算生存率的空白血漿組的0D 值。經計算，使T 細胞生存率最高的血漿濃度分別為10%補腎解毒中劑量組（96.0%）和10%健脾解毒小劑量組（95.3%）。將以上兩個濃度作為正式實驗的干預濃度。依據目前國內學者報道的藥物血漿最佳培養時間48 h 作為進一步研究的培養時間[13]。

1.8 指標檢測及方法

1.8.1 T 細胞表面分子表達檢測 取制備好的T 細胞懸液，加入l.5 mL EP 管中，分6 管，每管200 μL，分別加入熒光標記鼠抗人CD3-Percp (多甲藻葉綠素蛋白)，CD4-FITC（異硫氰酸熒光素)，CD8-PE（藻紅蛋白熒光素），CD28-FITC 各20 μL，輕輕混勻，4 ℃孵育30 min，再用PBS 洗細胞2 次以去除未結合的游離單抗，最后以1%多聚甲醛500 μL重懸固定細胞，并用Percp、FITC、PE 標記的鼠抗人IgG 作對照。用流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD28+的表達水平。

1.8.2 干擾素-γ（IFN-γ）的水平檢測采用ELISA 法檢測T 細胞培養上清液IFN-γ 水平，按試劑盒說明書操作。

1.9 統計學方法

數據采用SPSS 13.0 統計軟件，計量資料實驗結果以 “±s” 表示，先進行正態性及方差齊性檢驗，兩組間比較滿足正態性及方差齊性時用成組t檢驗，方差不齊時用t＇ 檢驗；多組間比較用方差分析，兩兩比較用q 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組各時間點CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表達比較

兩組CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表達較健康組均下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；各組健脾解毒藥物血漿與補腎解毒藥物血漿干預后CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+分子表達均有升高，與干預前比差異有統計學意義（P＜0.05）；免疫耐受組中，補腎解毒藥物血漿干預后CD8+及CD28+分子表達高于健脾解毒組 （P＜0.05）；兩種藥物血漿分別干預后，CD28+分子表達均高于免疫清除組同期。見表1。

表1 各組各時間點CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表達比較 （%，±s）

表1 各組各時間點CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表達比較 （%，±s）

注：與本組干預前比較*P＜0.05；與相同免疫狀態健脾解毒組比較△P＜0.05；與免疫清除組同期比較▲P＜0.05；與健康組比較▽P＜0.05。

組 別 n 劑 量(g/mL) 時 間 CD 3 CD4 CD8 CD28 免 疫 耐 受 18 干 預 前 58.05±4.40 34.45±2.55 29.62±3.11 44.36±3.43 空白血漿 18 — 干預后 57.43±2.87 32.67±3.53 29.34±4.16 44.53±3.43 補 腎 解 毒 18 9.71 干 預 后 64.35±2.34 39.23±3.48 34.23±2.15 52.40±2.35健 脾 解 毒 18 1.58 干 預 后 63.58±3.16 38.52±2.32 32.06±1.28 49.26±2.74 免 疫 清 除 18 干 預 前 62.29±3.60 37.34±4.16 30.82±1.98 45.76±4.31 空白血漿 18 — 干預后 61.62±2.73 36.03±3.46 29.53±4.36 45.78±3.63 補 腎 解 毒 18 9.71 干 預 后 64.35±2.63 40.13±2.52 32.64±3.53 48.26±2.38 健 脾 解 毒 18 1.58 干 預 后 64.26±2.37 39.37±2.34 32.78±4.21 47.32±3.23 健康 10 — 干預前 67.13±2.26 44.80±3.06 35.09±2.32 55.70±2.28

2.2 含藥血漿干預前后T 細胞分泌的IFN-γ 水平

含藥血漿干預前兩組IFN-γ 水平較健康組均偏低，差異有統計學意義（P＜0.05）；藥物血漿干預后，IFN-γ 水平較干預前均有升高（P＜0.05），兩組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組干預前后IFN-γ 水平比較 （ng/L，±s）

表2 各組干預前后IFN-γ 水平比較 （ng/L，±s）

注：與健康組比較*P＜0.05；與本組干預前比較△P＜0.05；與免疫清除組比較▲P＜0.05。

組別免疫耐受免疫清除健康n 18 18 10干預前275.64±47.32*▲286.73±43.64*334.50±43.28干預后補腎解毒 健脾解毒293.45±45.36△ 291.66±44.53△294.37±42.34△ 293.36±43.55△334.23±42.35 333.26±41.56

3 討論

近年來研究發現突破免疫耐受，清除病毒關鍵在于啟動或激發機體特異性的細胞免疫反應，而細胞免疫反應的強弱與機體免疫細胞功能狀態密切相關。HBV 感染人體后，機體主要依靠細胞毒效應與非細胞毒效應兩種免疫機制清除病毒，其中T 淋巴細胞參與的細胞毒效應起主要作用。機體的特異性細胞免疫包括CD8+細胞毒性T 淋巴細胞(CTL)和CD4+輔助性T 淋巴細胞(Th)。CD4+T 淋巴細胞是機體抗病毒免疫應答的中心環節，其數量的下降可直接影響免疫調節功能，造成宿主體液免疫和細胞免疫缺陷，最終導致患者體內HBV 清除緩慢而不徹底[14]。CD8+T 淋巴細胞有直接被HBV 感染的肝細胞激活的特性，作為免疫應答損害被感染的肝細胞，同時也清除病毒。因此，HBV 感染患者T 淋巴細胞亞群CD4+和CD8+是反映機體免疫狀態和功能的重要指標，對HBV 的感染及乙肝的慢性化有重要意義，在一定程度上可以反映機體細胞免疫調節功能。此外，CD28+是T 淋巴細胞表面重要的共刺激分子，它參與T 細胞活化信號的轉導，使T 細胞活化、增殖、啟動和維持免疫應答。因此，它對于誘導和維持T 細胞介導的免疫應答具有十分重要作用[15-16]。

慢性HBV 感染屬中醫學 “黃疸”、“脅痛”、“臌脹”、“積聚”等范疇，其外因是濕熱疫毒內侵，內因歸屬脾腎二臟虧虛[5]。病理基礎屬于本虛標實，在正邪斗爭的過程中，機體的免疫功能處于紊亂狀態，正氣虧虛不能完全行使清除邪氣(HBV)的功能，病理狀態得不到修復，致使疾病纏綿難愈。標本兼治符合慢性HBV 感染病因病機，本實驗采用補腎解毒方和健脾解毒方干預HBV 慢性感染患者外周血T 淋巴細胞，探討兩種治法對HBV 慢性感染不同狀態T淋巴細胞功能的影響，不僅有利于進一步明確慢性HBV 感染患者發病的中醫臟腑病機，而且為臨床治療慢性HBV 感染患者提供科學可靠的治療思路和實驗基礎。

本研究發現，免疫耐受組與免疫清除組兩組CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表達較健康組均下降，說明慢性HBV 感染患者機體T 淋巴細胞表達低下，存在免疫功能缺陷或不足。各組健脾解毒藥物血漿與補腎解毒藥物血漿干預后CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+分子表達均有升高，而免疫耐受組中，補腎解毒藥物血漿干預后CD8+及CD28+分子表達高于健脾解毒組，同時兩種藥物血漿分別干預后，CD28+分子表達均高于免疫清除組同期。此外，含藥血漿干預前兩組IFN-γ 水平較健康組均偏低，而藥物血漿干預后，IFN-γ 水平較干預前均有升高。由此證實兩種藥物血漿干預均能促進T 淋巴細胞表面分子的表達，通過補腎解毒方與健脾解毒方在一定程度上可以促進機體免疫功能的改善或恢復，并且補腎解毒方藥物血漿更能促進T 淋巴細胞的表達，為今后慢性HBV 感染的臨床治療提供了可靠的實驗依據與方向。本實驗只選取了一些指標進行觀察，且樣本量有限，不能全面反映慢性HBV 感染患者機體免疫功能狀態，且未做臨床多中心研究，有待在今后的實驗和臨床中進一步完善。

[1]WalterR Wilson，Merle A Sande.Diagnosis Treatment in infectious diseases[J].Hepatology，2005，48(6):439-440，442-447.

[2]劉建平，秦獻魁，Heather McIntosh.中草藥治療慢性乙型肝炎隨機對照試驗的系統評價[J].中國中西醫結合雜志，2002，22(1):58-61.

[3]趙 鋼，陳建杰.王靈臺教授論補腎法為主治療慢性乙型肝炎的機制[J].中國中西醫結合雜志，2005，25(1):78-79.

[4]李 曼，姚 嫣，高月求.補腎方對慢性乙型肝炎T 淋巴細胞免疫效應分子表達的影響[J].中西醫結合肝病雜志，2009，19(5):266-268.

[5]蔣 淼.對乙型肝炎“正復勝邪現象”的臨床分析[J].中醫雜志，2000，41(12):730-732.

[6]錢 乙.小兒藥證直訣·卷下[M].北京:人民衛生出版社，2006:6.

[7]王孟英.溫熱經緯[M].北京:人民衛生出版社，2005:8.

[8]宋·太平惠民各劑局.太平惠民和劑局方[M].北京:人民衛生出版社，2007:7.

[9]中華醫學會肝病學分會，中華醫學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南[M].北京:人民衛生出版社，2005:3-7.

[10]賀石林，王 鍵，王凈凈.中醫科研設計與統計學[M].長沙:湖南科學技術出版社，2003：36.

[11]李儀奎，吳健宇.血清藥理實驗中采血時間的通法方案[J].中國藥理學通報，1999，15(6):569-570.

[12]劉 武，夏雄智，胡 敏，等.制作六味地黃丸含藥血清有關問題的思考[J].中國中醫急癥，2007，16(7):854-855.

[13]李 萍，胡國齡，劉洪波，等.抗纖二號藥物血清對活化型肝星狀細胞的影響[J].中華肝臟病雜志，2005，10 (2):137-140.

[14]Suri D，Schilling R，Hopes A，et al.Non-cytolytic inhibition of Hepatitis B virus replication in human hepatocytes [J].Jepatol，2001，35(35):790-797.

[15]張 儀，韓 波.CD28 在疾病治療中的作用研究進展[J].實用兒科臨床雜志，2008，23(15):1 204-1 206.

[16]鄒志強，于吉廣，林治輝.e 抗原陰性的慢性乙型肝炎患者T 淋巴細胞CD28 與免疫耐受的關系 [J].中國醫師進修雜志，2007，30(11):28-29.