香榧體細胞胚發生的初步研究

姚 進，黃堅欽，胡恒康，裘林艷，朱旻華，張啟香

(1.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安311300；2.上海園林綠化建設有限公司，上海 200333；3.浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 臨安 311300)

香榧Torreya grandis‘Merrillii’是實生榧樹Torreya grandis的優良變異類型或優株經人工嫁接繁殖而成的的優良品種[1]，為中國特有的珍稀干果樹種，經濟壽命長，栽培效益高，具有巨大的發展潛力[2]。長期以來，香榧的繁殖主要通過嫁接等方法進行，繁殖技術落后，繁殖系數低，嚴重制約了香榧的大規模栽培，因此，開展香榧離體快繁技術的研究對推動香榧產業擺脫發展瓶頸，提升產業規模具有重要意義。關于香榧離體快繁的研究僅國內有報道，至今尚未建立高效、穩定的再生體系。2004年姜新兵等[3]首次報道了香榧體細胞胚胎發生的研究，但僅停留在體胚的增殖階段；劉海琳等[4]以香榧莖段為外值體，通過器官發生途徑，獲得了再生植株；金航標等[5]對香榧腋芽組培及嫩枝嫁接技術進行了初步研究。本試驗以香榧胚為外植體，研究了基本培養基、復合添加物、碳源和植物生長調節物質對香榧胚性愈合組織(callus)誘導的影響，篩選出胚性愈合組織誘導與增殖的適宜培養條件，初步進行了體細胞胚的誘導與萌發試驗，為進一步建立高效、穩定的香榧體胚發生和遺傳轉化體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料與外植體處理

香榧種子(圖1-1)采自浙江省富陽市洞橋鎮55年生香榧樹上，去除假種皮后，用洗滌劑漂洗干凈，自來水沖洗3～4 h。超凈工作臺上用體積分數為75%乙醇表面滅菌3 min，無菌水沖洗3～4次，稀釋10倍的次氯酸鈉溶液(50 mL加1滴吐溫)真空抽濾20 min，無菌水沖洗5～6次。表面滅菌后的種子用剪刀剪去外種皮，顯微鏡下剝取完整胚(胚處于早期心形胚階段，圖1-2)，接入相應培養基。

1.2 愈合組織誘導

1.2.1 基本培養基和復合添加物 在基本培養基 MS(Murashige-Skoog)[6]，SH(Schenk and Hildebrandt)[7]和 B5(Gamborg 等)[8]中分別添加不同種類復合添加物谷氨酰胺(Gln)，水解酪蛋白(CH)和肌醇，各 500 mg°L－1，并設置基本培養基空白對照，共12個處理。各個處理均附加0.10 mg°L－16-芐氨基腺嘌呤(6-BA)，0.50 mg°L－12，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，30 g°L－1蔗糖，9.5 g°L－1瓊脂，pH 5.7，暗培養。接種幼胚20個°處理－1，重復 3 次。

1.2.2 碳源及其質量濃度 研究不同質量濃度(20，30，45 g°L－1)葡萄糖、蔗糖和麥芽糖組成的9個處理對香榧愈合組織形成的影響。基本培養條件為 SH+0.10 mg°L－16-BA+0.50 mg°L－12，4-D+9.5 g°L－1瓊脂，pH 5.7，暗培養。接種20個胚°處理-1，重復3次。

1.2.3 植物生長調節物質 研究不同質量濃度6-BA(0，0.10，0.50，1.00 mg°L－1)，細胞激動素KT (0，0.10，0.50，1.00 mg°L－1)，2，4-D(0，0.10，0.50，1.00，2.00 mg°L－1)組合以及 6-BA(0，0.10，0.50，1.00 mg°L－1)，KT(0，0.10，0.50，1.00 mg°L－1)，NAA(0.10，0.50，1.00，2.00 mg°L－1)組合，共 32 個處理對香榧愈合組織形成的影響。基本培養條件為SH＋30 g°L－1蔗糖＋9.5 g°L－1瓊脂，pH 5.7，暗培養。接20個胚°處理-1，重復3次。

圖1 香榧體細胞胚的誘導與萌發Figure 1 Somatic embryogenesis of Torreya grandis ‘Merrillii’

1.3 胚性愈合組織形成和增殖

選擇生長勢基本一致的愈合組織轉入到較佳的胚性愈合組織誘導培養基，植物生長調節物質減少為1/2，4周繼代1次。胚性愈合的增殖試驗中，先將胚性愈合組織在待試驗處理中培養4周，統計第2次繼代的增殖情況，30管°處理-1，重復3次。

1.4 體細胞胚的誘導與萌發

以SH為基本培養基，添加ABA和PEG 6000，初步進行了體細胞胚的誘導試驗，獲得的體胚在1/2SH基本培養基上萌發。

1.5 數據統計分析

胚接種4周，在體視顯微鏡下觀察其生長狀況，統計各個處理的愈合組織形成率和褐化率。胚性愈合組織增殖試驗接入4周后稱量；接入的胚性愈合組織質量為G0=G2－G1，增殖4周的胚性愈合組織質量為G3=G5－G4；式中G1為培養基與試管的質量，G2為接入胚性愈合組織后試管的質量。G5為增殖后胚性愈合與試管的質量，G4為取出胚性愈合后的試管質量。實驗數據采用SigmaPlot 8.0和SPSS 17.0軟件進行統計分析，Duncan氏新復極差檢驗法進行多重比較。

愈合組織形成率(%)=(各個處理中形成愈合組織的外植體總數/各個處理中未污染的外植體總數)×100%；褐化率(%)=(各個處理褐化的外植體總數/各個處理中未污染的外植體總數)×100%；胚性愈合組織增殖倍數=G3/G0。

2 結果與分析

2.1 愈合組織誘導

2.1.1 基本培養基和復合添加物對愈合組織形成的影響 香榧胚接種到相應培養基上，大部分脫分化形成愈合組織或萌發產生子葉肥厚的畸形苗，少數胚褐化。幼胚一般2周左右開始膨大(圖1-3)，4周左右可見明顯的愈合組織。顯微鏡下觀察發現:誘導的愈合組織大致可分為2類:水漬狀愈合組織和疏松狀愈合組織。方差分析和多重比較結果(圖2)表明:不同處理中外植體愈合組織形成率和褐化率存在顯著性差異(P＜0.05)。基本培養基對愈合組織形成率的影響大于復合添加物。SH，MS和B5等3組試驗中，平均褐化率依次為MS＞B5＞SH，平均愈合組織形成率依次為SH＞MS＞B5。試驗的12個處理中，SH+Gln的愈合形成率最高，為50.8%。在SH和MS中添加500 mg°L－1Gln，有利于降低褐化率，提高愈合組織形成率，但形成的愈合組織多呈水漬狀，增殖速度慢且容易褐化。SH+肌醇和SH+CH處理的愈合組織形成率雖略低于SH對照處理，但其誘導的疏松愈合組織比例高，生長勢旺盛。

2.1.2 不同碳源對愈合組織形成的影響 不同碳源種類和質量濃度對香榧愈合組織形成的影響(圖3)存在顯著差異 (P＜0.05)。添加蔗糖組的形成率明顯高于葡萄糖組和麥芽糖組，蔗糖組和麥芽糖組產生的愈合組織多為金黃色疏松，偶有乳白色愈合組織，葡萄糖組水漬狀愈合組織比例較高。3種碳源不同質量濃度間的愈合組織形成率，隨著質量濃度的升高而降低，當蔗糖的質量濃度為20 g°L－1時愈合形成率最高，達51.3%；質量濃度為30 g°L－1，愈合組織形成率為47.5%，可能由于碳源量充足，愈合組織生長量比 20 g°L－1高。

2.1.3 植物生長調節物質對愈合誘導的影響 以SH為基本培養基，6-BA，KT，2，4-D等3種植物生長調節物質不同質量濃度配比均能誘導形成愈合組織。方差分析與多重比較結果(表1)顯示:各處理的愈合組織形成率和褐化率差異性顯著(P＜0.05)。培養基中不添加6-BA時，隨著2，4-D濃度的升高，愈合組織誘導率逐漸下降，疏松愈合組織數也依次減少，0.10 mg°L－12，4-D的愈合組織誘導效果最好，誘導率為52.1%。當2，4-D為0.50 mg°L－1，愈合組織誘導率隨BA質量濃度的升高而下降。添加1.00 mg°L－1的KT，能降低褐化率。從表1和表2的結果來看，以SH為基本培養基，單獨添加低質量濃度的NAA或 2，4-D對愈合組織形成有促進作用，低質量濃度的NAA比低質量濃度的2，4-D效果好。表3中6-BA，KT和NAA不同質量濃度水平的愈合組織誘導率和褐化率差異性顯著(P＜0.05)。隨著6-BA質量濃度的升高平均愈合組織誘導率逐漸降低，培養基中不添加6-BA時，愈合組織平均誘導率最高。0.10 mg°L－1NAA處理的誘導率最高，為60.1%，且大部分愈合呈疏松狀。4組6-BA處理的外植體褐化率隨著KT質量濃度的升高呈先升高后降低趨勢，在6-BA為0.10 mg°L－1，并添加0.10 mg-L－1KT和0.10 mg°L－1NAA的培養基上，褐化率最低，僅為2.4%。試驗中還發現當6-BA和NAA質量濃度均較高時，幼胚多萌發產生子葉肥厚的畸形苗。

圖2 基本培養基和復合添加物對香榧愈合組織形成的影響Figure 2 Effect of basal media and composite additives on callus formation of Torreya grandis ‘Merrillii’

圖3 不同碳源對香榧愈合組織形成的影響Figure 3 Effect of carbon sources on callus formation of Torreya grandis ‘Merrillii’

表1 6-BA，KT和2，4-D對香榧愈合組織形成的影響Table 1 Effect of 6-BA，KT and 2，4-D on callus formation of Torreya grandis ‘Merrillii’

2.2 胚性愈合組織的形成和增殖

2.2.1 胚性愈合組織的形成 篩選生長勢基本一致的愈合組織分別轉入到較佳的愈合組織誘導培養基，植物生長調節物質減少為 1/2，即 SH+0.05 mg°L－16-BA+0.25 mg°L－12，4-D，SH+0.05 mg°L－12，4-D，SH+0.05 mg°L－1NAA。水漬狀愈合組織接種1周后即褐化，幾乎停止生長，只有疏松狀愈合組織能繼續增殖(圖1-4)。疏松狀愈合組織在SH+0.05 mg°L－1NAA培養基上，3周左右開始產生乳白色半透明的胚性愈合組織(圖1-5)，并能大量增殖(圖1-6)。疏松狀愈合組織在 SH+0.05 mg°L－16-BA+0.25 mg°L－12，4-D，SH+0.05 mg°L－12，4-D培養基上生長緩慢，易發生褐化，需要2～3次的繼代，增殖速度才開始加快。繼代過程中 SH+0.05 mg°L－12，4-D 培養基上能產生乳白色愈合組織，而 SH+0.05 mg°L－16-BA+0.25 mg°L－12，4-D 培養基上多形成淡黃色顆粒狀愈合組織。

表2 6-BA，KT和NAA對香榧愈合組織形成的影響Table 2 Effect of 6-BA，KT and NAA on callus formation of Torreya grandis ‘Merrillii’

2.2.2 胚性愈合組織的增殖 為了獲得適宜的胚性愈合組織增殖培養基，根據前期愈合組織誘導效果篩選了5個處理進行了篩選試驗。結果(表3)表明:以4周作為1個繼代周期，不同處理間的增殖倍數存在顯著差異(P＜0.05)。SH基本培養基的增殖倍數最大，達9.7，但易出現玻璃化。SH+0.05 mg°L－1NAA的增殖效果最好，而且多次繼代后，胚性培養物仍呈乳白色、透明狀。胚性愈合組織在SH+0.05 mg°L－1KT+0.25 mg°L－1NAA 上繼代后多產生乳白色黏稠愈合組織。在 SH+0.05 mg°L－16-BA+0.10 mg°L－12，4-D 培養基上胚性愈合組織增殖過程中易失去胚性，表現為褐化或黃色黏稠狀。

表3 胚性愈合組織的增殖結果比較Table 3 Effect of plant growth regulators on embryogenic tissue proliferation

2.3 體細胞胚的誘導與萌發

初步的實驗結果表明:在添加ABA和PEG6000的SH培養基上培養2～3周，胚性愈合組織能產生體胚(圖1-7)，實驗的3個處理中，5 mg°L－1ABA+10 g°L－1PEG 6000培養基上形成的體胚數最多且畸形體胚比例較小。體胚在弱光(1 200 lx)下(圖1-9)的萌發效果比黑暗條件(圖1-8)下好。部分體胚在1/2SH基本培養基上萌發，子葉展開良好，但部分體胚發育至早期胚時期便開始脫分化，形成畸形體胚。

3 結論與討論

香榧幼胚接入不同培養基上，誘導形成的愈合組織大致可分為水漬狀愈合和疏松狀愈合2類。水質狀愈合組織易褐化，幾乎不生長，只有疏松狀愈合組織能繼續增殖。香榧幼胚愈合組織誘導的基本培養基應選擇SH為宜，碳源以蔗糖最好。于大德等[9]指出，添加Gln作為氮源可有效提高云南松Pinus yunnanensis成熟合子胚的愈合組織誘導率并減少褐化比例。本研究中也發現在SH和MS中添加500 mg°L－1Gln，有利于降低褐化率，提高愈合組織誘導率，但誘導的愈合組織多呈水漬狀，且容易褐化。SH+肌醇和SH+CH等2個處理誘導的愈合組織質量雖較高，但愈合組織形成率卻低于SH對照處理。可見，Gln，肌醇和CH對幼胚愈合組織發生的誘導效果不明顯。

不同發育階段的外植體由于生理狀態不一樣，會對相同的培養條件產生不同反應[10－11]，針葉樹種合子胚的發育階段，是影響其愈合組織形成的關鍵因素[12－14]。姜新兵等[3]曾報道在 SH+0.1 mg°L－16-BA+0.5 mg°L－12，4-D 培養基上，胚的愈合誘導率可達 69.8%。本研究發現，SH+0.1 mg°L－1BA+0.5 mg°L－12，4-D培養基上的愈合誘導率均在50%以下，可能是由外植體的采集時期不同引起。高質量濃度的2，4-D，BA和KT組合對多數針葉樹種合子胚快速誘導形成愈合組織有利；冷杉Abies fabri屬樹種的胚發生培養物也可在只含細胞分裂素而無任何生長素的培養基上誘導產生[15]，而NAA激素組合比2，4-D組合更有利于東北紅豆杉Taxus cuspidata的愈合組織誘導[16]。本研究中，NAA或2，4-D與其他生長調節物質的組合使用，愈合組織誘導效果不明顯，低質量濃度NAA或2，4-D單獨使用促進愈合組織發生，尤以低質量濃度NAA的效果最好，當NAA為0.1 mg°L－1時，愈合組織形成率達60.1%。

2，4-D在植物胚性愈合組織的誘導中起著重要作用[17]，松柏類植物胚性組織誘導一般需要添加2，4-D，但在胚性組織增殖階段，應該及時去掉或降低2，4-D質量濃度[18]。華北落葉松Larix principis-rupprechtii胚性愈合組織長期在含有高質量濃度2，4-D的培養基上繼代，會導致體細胞胚成熟能力的喪失，用NAA代替2，4-D明顯提高了成熟胚的質量[19]。香榧胚性愈合組織的誘導必須去掉2，4-D[20]。本試驗中，2，4-D不利于胚性愈合組織的形成和增殖，SH+0.05 mg°L－1NAA是胚性愈合組織形成和增殖最理想培養條件。

體細胞胚的成熟和萌發是多數木本植物建立體細胞胚再生體系時的主要難題[21]。姜新兵等[3]首次獲得了香榧體細胞胚，但未提及體胚成熟和萌發問題。本研究發現，香榧的體胚發生有一定難度，次生胚發生率較高，一定程度上抑制了體胚的成熟，在1/2SH基本培養基上部分體胚發育至早期胚時期便開始脫分化，形成畸形體胚，僅少量體胚萌發，子葉展開良好。因此，仍需加強對體胚誘導、成熟和萌發條件的系統研究，為建立高效穩定的香榧體胚發生和遺傳轉化體系鋪平道路。

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