鉬酸銨分光光度法測定磷濃度實驗方法的改進

申 禹，李 玲

（清華大學 水沙科學與水利水電工程國家重點實驗室，北京 100084）

磷是水環境中營養元素之一，是水體浮游藻類生長的限制性營養元素，水中磷的含量與水體發生富營養化現象密切相關。磷在水體中的含量是生產、科研中經常遇到的問題。目前磷濃度測定的方法很多，按照測定原理，可分為陰離子交換樹脂法（離子色譜法）和化學方法（分光光度法）等［1］；按照化學反應過程的不同，可分為鉬酸銨分光光度法、孔雀綠－磷鉬雜多酸法以及羅丹明熒光分光光度法等。鉬酸銨分光光度法［2］，簡單易行、快速準確，得到了廣泛的應用。隨著這種測定方法的不斷推廣，在應用中出現了一些問題，比如工作波長的選擇、顯色反應時間的選取、樣品pH值范圍的確定等。目前有許多學者對鉬酸銨分光光度法測定磷濃度的實驗方法進行了修正。梁運江等［3］應用756CRT型紫外可見分光光度計進行600～850nm范圍內的波長掃描，在690nm處出現局部吸收峰值，而最大吸收峰在722.2nm附近，830nm以上吸光度出現鋸齒形波動，由于某些原因給出的工作波長未得到廣泛認可。黃城等［4］認為鉬銻抗法顯色時間長，不穩定，磷含量少時顯色不明顯，且受pH值影響比較大，結合海藻中磷的測定，提出苯二酚、Na2SO3還原法。吳海燕［5］認為鉬銻抗法存在過量的鉬酸銨和還原劑，造成假陽性顯色而干擾測定，利用硝酸鉍與磷鉬酸銨形成離子締合物顯色體系進行了改良。此外，對于色度濁度補償［6］、連續流動分析［7］、水樣冰凍時間的影響［8］等已有較成熟的研究。另外有很多學者對于水樣采集、標準磷系列消解、溫度、pH值、顯色反應時間等問題進行探討［9－15］，積累了大量實驗經驗。以上研究雖然在某些方面取得了一定的進展，但所做的研究工作缺乏系統性和完整性。本研究將針對鉬銻抗法測定磷濃度的實驗中顯色反應時間、樣品pH值范圍、最佳工作波長等問題逐一進行探討，并給出應用這種方法測定磷濃度實驗方法的改進建議。

1 鉬酸銨分光光度法的測量原理

鉬酸銨分光光度法的化學機理是正磷酸鹽與鉬酸銨反應生成能穩定顯色的磷鉬藍，光學機理為朗伯－比爾定律。在酸性介質中，正磷酸鹽與鉬酸銨反應，生成黃色的磷鉬雜多酸（磷鉬黃），反應式為

室溫下，在酒石酸銻鉀（銻離子）或硝酸鉍（鉍離子）的催化作用下，磷鉬雜多酸立即被抗壞血酸或氯化亞錫還原，轉化成穩定的藍色絡合物——磷鉬藍（H3PO4·10MoO3·Mo2O5或 H3PO4·8MoO3·2Mo2O5），這一反應稱為顯色反應。

磷鉬藍呈現藍色，會選擇性吸收與藍色光互補的紅色光（波長約為700nm）。磷鉬藍的藍色深度與磷的含量在一定質量濃度范圍內（大約0.8mg／L）服從朗伯－比爾定律，即溶液對單色光的吸收與溶液濃度及單色光通過的液層厚度成正比。光的吸收程度用吸光度表示，其定義式為

其中Iin為入射光強度，Iout為透射光強度為透光度，可表示為百分比形式。

朗伯－比爾定律用公式表示為

式中，a為吸光系數（L／（g·cm））；b為液層厚度（cm）；c為溶液質量濃度（g／L）。

若c以mol／L為單位，b以cm為單位，則寫為

ε稱為摩爾吸光系數（L／（mol·cm）），表示吸光物質的濃度為1mol／L、液層厚度為1cm時溶液對某單色光的吸收能力，是衡量分光光度分析靈敏度的重要標志。一般認為當ε＞104L／（mol·cm）時比較靈敏，ε＜103L／（mol·cm）時不靈敏。

摩爾吸光系數與波長有關，一定濃度的溶液在不同波長下，測得吸光度最大時對應的波長為最大吸收波長，對應的摩爾吸光系數也最大，波長微小波動對吸光度的影響也最小，測定溶液濃度的精確度和靈敏度最高。

2 測量方法分析

根據鉬酸銨分光光度法的原理，磷濃度測定的準確性依賴于朗伯－比爾定律的適用性和磷鉬藍的顯色效果。影響朗伯－比爾定律適用性的因素包括單色光的純度、工作波長、樣品濃度等；影響磷鉬藍顯色反應的因素包括樣品pH值、環境溫度、顯色反應時間、干擾離子的存在及色度、濁度等。單色光的純度屬于儀器精度的問題，干擾離子、色度和濁度與樣品本身有關，環境溫度一般選擇室溫，而顯色反應時間的控制、工作波長的選擇、顯色反應時的pH值等則與實驗操作有關。因此磷濃度測定中應弄清以下問題：樣品消解的必要性，合適的顯色時間跨度，最佳工作波長，合適的樣品pH值范圍。

首先，消解的目的是把總磷轉化為正磷酸鹽，理論上用正磷酸鹽配制的標準溶液及樣品溶液不需要消解，因為樣品的消解過程比較耗時，如果在研究中能省略消解過程將會提高磷濃度測定效率，但省略消解過程需要實驗驗證。

其次，測定吸光度應在藍色絡合物磷鉬藍穩定顯色時測定，同時測定多份樣品（如繪制工作曲線）時很有必要確定穩定顯色的時間跨度，顯色穩定前可能顯色不充分，超過穩定顯色時間后顯色可能褪去。顯色反應與溫度有關，因此不同環境溫度下應確定相應的顯色時間跨度。

再次，工作波長為最大吸收波長時，同一濃度的樣品吸光度最大，分光度測定的分辨率高，而且在吸光度隨波長連續平滑變化的曲線上，吸光度出現峰值時斜率為0，曲線最平坦，此時由于單色光不純等原因導致波長微小擾動，對吸光度的影響最小。不同型號的分光光度計顯示的最大吸收波長可能不同，因此有必要通過實驗確定最佳工作波長。

最后，顯色反應一般是在酸性環境下進行，對于不經消解而直接進行顯色反應的樣品，樣品初始pH值可能對顯色反應造成影響，目前沒有這方面的資料，本文通過實驗來確定不消解的樣品合適的pH值范圍。

3 實驗方法的改進

（1）選擇合適的顯色反應時間跨度。參照國家標準水質總磷的測定（GB l1893—1989，以下簡稱標準方法），取5mL磷標準溶液（50mg／L）稀釋到250mL定容，得到1.0mg／L的磷溶液。分別取1.0mg／L的磷溶液25mL于14支50mL比色管中，加蒸餾水稀釋至50mL，先后滴加1mL抗壞血酸溶液和2mL鉬酸鹽溶液，靜置3、5、10、15、20、25、30min，各取2支比色管中的磷溶液分別在700nm波長下測定吸光度。根據吸光度A的變化確定顯色反應時間t跨度，結果如圖1所示。

圖1 吸光度隨顯色反應時間的變化

本實驗在室溫20℃下進行，圖1表明顯色反應時間在5～25min內，吸光度無顯著性變化，因此確定此溫度下合適的顯色反應時間跨度為5～25min，在此顯色反應時間跨度內，溶液能穩定顯色，吸光度測定應在此時間跨度內完成。顯色反應也是一種化學反應，反應時間與溫度有關，實際操作時應根據環境溫度按此方法確定合適的顯色反應時間。

（2）確定最佳工作波長。取1.0mg／L的溶液25 mL于2支50mL比色管中，加水至50mL，并加抗壞血酸和鉬酸鹽進行顯色反應，在合適的顯色時間跨度內，分別設定波長為680、690、700、705、710、715、720、730nm，測定并比較吸光度，結果如圖2所示。圖2表明，當波長為710nm時，吸光度達到峰值，峰值很平緩，在705～715nm范圍內吸光度基本無變化，且波長的微小波動對濃度測定基本無影響，由此確定實驗最佳波長為710nm。

（3）分析消解對正磷酸鹽濃度測定的影響。取已知濃度正磷酸鹽溶液，分別經過消解和不經過消解后測定磷濃度，結果如圖3所示。

圖3表明，正磷酸鹽溶液經消解與不經消解，測得吸光度無顯著性變化。不經消解測定磷濃度主要用于實驗研究，由于消解過程需要加熱30min，而且要待溶液冷卻，比較耗費時間，對于像吸附磷一類的實驗研究中大量樣品高密度的測定極不方便。通過實驗確定不消解對測定結果無影響后，可減少部分實驗工作量。

圖2 吸光度隨波長的變化

圖3 消解對正磷酸鹽濃度測定的影響

（4）預估合適的樣品pH值范圍。取5支比色管分別加入約40mL水，用HCl和NaOH調節溶液pH值分別為3、5、7、9、11；另取15支50mL比色管分成5組，每組3支，其中1支作為空白對照，另外2支形成重復對照，用移液管分別加入0.5mL磷濃度為50 mg／L的磷標準貯備溶液，每組空白對照分別加蒸餾水至50mL，重復對照則各加入大約30mL水，用HCl和 NaOH 調節溶液pH 值分別為3、5、7、9、11，調節好后總體積小于50mL，滴加pH值對應相等的水至50mL。此時獲得pH 值分別為3、5、6、7、8、9、11，磷質量濃度均為0.5mg／L的系列溶液，加抗壞血酸和鉬酸鹽進行顯色反應，測定吸光度。實驗測得吸光度隨樣品pH值的變化如圖4所示。

圖4 樣品pH值對顯色反應的影響

圖4表明，pH值在3～11范圍內，同一質量濃度、不同pH值的磷酸鹽溶液，用鉬酸銨分光光度法測得的吸光度值相差不大，故實驗中可不考慮pH值對顯色反應的影響。事實上，由于抗壞血酸和鉬酸鹽溶液均為強酸，經實驗測定，即使樣品溶液pH值為12，顯色反應后pH值也小于2，足以滿足顯色反應酸性環境的要求。

（5）確定工作曲線及合適的磷質量濃度范圍。配制磷質量濃度為0.0、0.02、0.04、0.12、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg／L的標準系列正磷酸鹽溶液，在最佳工作波長下和合適的時間跨度內測定吸光度，實驗數據見圖5。并利用已知濃度溶液進行回收率實驗。

圖5 工作曲線及線性范圍

圖5表明，根據樣品質量濃度小于0.8mg／L的實驗數據可擬合出線性回歸方程為c＝2.026A，R2＝1.000，P＜0.001，并且回收率在98%～103%之間。若可讀取的最小吸光度為0.001，則最低檢測限約為0.002mg／L。同時磷質量濃度為1.0mg／L時，測定結果開始偏離擬合的直線，說明吸光度隨磷質量濃度線性變化的磷質量濃度范圍為0～0.8mg／L。因此考慮到測定結果的精度，測定時應預估樣品磷質量濃度，并稀釋至0.1～0.8mg／L范圍內進行測定，這樣鉬酸銨分光光度法就可測定任意質量濃度的磷。

4 結論

本文依據鉬酸銨分光光度法的測量原理，介紹了采用鉬酸銨分光光度法測定磷濃度的實驗方法，并對其進行了修正，可得到如下結論：

（1）測定前根據實驗確定最佳工作波長為710 nm，確定實驗溫度條件下的顯色時間跨度，如在室溫為20℃時吸光度測定操作可在加完鉬酸鹽溶液后5～25min內完成，確定實驗標定曲線。另外測定正磷酸鹽濃度時無需消解，一般也無需調節樣品初始pH值（3～11范圍內）。

（2）測定前預估樣品磷質量濃度并稀釋至實驗標定曲線的線性范圍內，即確保磷質量濃度在0.1～0.8 mg／L范圍內進行測定。

（3）如果樣品量較少，可換用25mL比色管進行顯色反應，鉬酸鹽溶液和抗壞血酸溶液相應減半，對測定結果無影響。當需要同時測定多組樣品的磷質量濃度時，可使用滴定管滴加抗壞血酸和鉬酸鹽，使用一次性滴管向比色皿里添加反應液，測完后用注射器抽出溶液，可在不影響實驗精度的前提下提高測定效率。

（4）可以采用空白溶液對分光光度計進行標零，以水作參比，標定吸光度為0，所測吸光度不需再扣除空白試樣的吸光度。

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