表達M2e－EYFP融合蛋白的轉基因柔嫩艾美耳球蟲生物學特性分析

李秋明，張 嵩，李 喆，劉賢勇

（1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193；2.北京農學院動物科學技術學院，北京 昌平102206）

目前正在研制或已經研制成功的雞球蟲疫苗可分為雞球蟲常規活疫苗（強毒和弱毒疫苗）和基因工程疫苗兩大類。其中基因工程疫苗主要由亞單位疫苗、核酸（DNA）疫苗和活載體重組疫苗構成。活載體重組疫苗又可分為兩種形式，一種是以細菌或病毒為載體的球蟲抗原重組疫苗；另一種是以活球蟲為載體將其他病原微生物有效抗原轉入球蟲基因組中，通過球蟲的常規感染激發球蟲免疫應答，同時誘發對其他疾病的保護。后者的設想由索勛（2006）提出，并申請專利－球蟲的新用途［1－2］。目前該項研究已經取得重大進展，本文即是對已經獲得的表達M2e－EYFP融合蛋白的轉基因柔嫩艾美耳球蟲（以下簡稱轉基因球蟲）生物學特性進行分析，并與其受體－野生型柔嫩艾美耳球蟲（以下簡稱野生型球蟲）相比較，為轉基因球蟲及其產品的安全性評價奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 野生型球蟲，雞柔嫩艾美耳球蟲北京株（WildEimeriatenellaBJ，Et－W）。 轉 基 因 球 蟲（TransgenicE.tenellaBJ，Et－T），是以野生型球蟲為載體通過限制性內切酶介導的整合方法（REMI）獲得的表達融合M2e－EYFP（禽流感病毒基質蛋白胞外結構域－增強型黃色熒光蛋白）蛋白的單孢子囊篩選后的子代卵囊。

農大3號雄性鑒別雛雞，無球蟲飼養至試驗所需日齡時使用。昆明系小鼠、家鴿市購，于實驗室條件下觀察一周后使用。

1.2 方法 卵囊形態、大小和最小潛在期檢測：轉基因球蟲和野生型球蟲卵囊各測量250個，每個卵囊測量最長和最寬值（單位μm），平均長度與平均寬度的比值為卵形指數，用于判斷卵囊形態。最小潛在期為糞便中最早見到第一批子代卵囊的時間［3］。檢測方法參見孔繁瑤（1997）和索勛（1998）中的描述［4－5］。

繁殖力檢測：球蟲的繁殖能力通常用口服已知數量的卵囊所產生的總卵囊數來表示［5］。方法：轉基因球蟲和野生型球蟲卵囊分別感染7日齡雛雞15只，5只/籠，三個重復組。劑量1 000個孢子化卵囊/只。感染后自最早產出卵囊時開始每隔24h收集1次全部糞便，采用麥克馬斯特氏法（Mc－Master method）計數卵囊產量，連續7d［4，6］。

卵囊排出顯露期檢測：10只7日齡雛雞隨機分成兩組，籠上飼養，分別感染轉基因球蟲和野生型球蟲卵囊，劑量1 000個孢子化卵囊/只。感染后第5天開始每天更換雞籠直至試驗結束。感染后第13天開始，每日采用麥克馬斯特氏法檢查卵囊排出情況，直至不能檢測到卵囊為止。

最短孢子化時間檢測：在Norton（1983）方法的基礎上改用盲腸卵囊收集法迅速獲得卵囊［7］。操作如下：轉基因球蟲和野生型球蟲感染雞分別于感染后第8天剖殺收集盲腸糞便卵囊，麥克馬斯特氏法計數卵囊濃度，并用2.5%重鉻酸鉀液調整至50 000個卵囊/mL，取100mL卵囊液放入250mL三角瓶中于振蕩器中孢子化（溫度28℃，轉速130 r/min離心），以上過程要求在半小時內完成。自入振蕩器中開始計時，于孢子化第10小時開始每隔1 h感染3只無球蟲雞，直至孢子化第19小時。雛雞感染后第7天剖殺，盲腸抹片鏡檢是否有卵囊產出，以最早檢出卵囊的感染用卵囊的孢子化時間為最短孢子化時間。

寄生宿主和寄生部位的特異性、致病性和免疫原性觀察：120只21日齡試驗雞逐只稱重，隨機分組，10只/組，籠上飼養。分別感染轉基因球蟲和野生型球蟲卵囊，劑量為200、500、1 000、10 000個和50 000個孢子化卵囊/只，同時設空白對照組和不感染攻毒組。另外，200～1 000個劑量組每組增加感染5只，單籠飼養用作剖殺記盲腸病變分。感染后第7天逐只稱重，10 000個和100 000個劑量組雞全部剖殺，200～1 000個劑量組剖殺單籠飼養的雛雞，被剖殺雞記盲腸病變分，其余未剖殺雞繼續飼養留作免疫原性試驗。盲腸病變記分按Johnson和Reid（1970）設計的病變記分法進行［8］。致病性試驗結束后，剩余雞繼續飼養，一周后，除空白對照組外全部攻毒，劑量50 000個孢子化卵囊/只。攻毒后密切觀察臨床癥狀，一周后逐只稱重，記盲腸病變分和檢測盲腸卵囊總產量。

另外，轉基因球蟲和野生型球蟲分別對10只小鼠和5只家鴿進行高劑量（50 000個孢子化卵囊/只）接種，感染后第7天開始每隔1天進行糞便中卵囊產出情況的檢查，同時密切觀察臨床癥狀1個月。

2 結果

卵囊形態大小、最小潛在期、繁殖力、卵囊排出顯露期和最短孢子化時間：結果見表1。數據顯示，轉基因球蟲和野生型球蟲的卵囊大小和卵囊產量存在顯著差異，最小潛在期和卵囊排出顯露期亦具波動性。轉基因球蟲的最小潛在期139h，野生型球蟲126h。轉基因球蟲從感染后第6天開始，最短至第16天，最長至第19天可以檢出卵囊；而野生型球蟲卵囊可以檢出的時間穩定在感染后6～14d。

表1 轉基因球蟲和野生型球蟲的卵囊形態大小、最小潛在期、卵囊產量、卵囊排出顯露期和最短孢子化時間檢測

寄生宿主和寄生部位的特異性：轉基因球蟲和野生型球蟲高劑量接種的非靶動物小鼠和家鴿自感染后第7天至1個月后糞便中均未檢出雞球蟲卵囊。所有動物未見異常臨床癥狀，直至試驗結束時全部存活。但兩種球蟲對雞具有明顯的致病性，不同感染劑量致病力有差異性，尤其高劑量組甚至引起雞死亡（見表2）。剖殺雞腸道抹片鏡檢卵囊顯示兩種球蟲寄生部位均為盲腸及附近腸組織，十二指腸、小腸黏膜抹片鏡檢未見卵囊。

致病性和免疫原性：轉基因球蟲和野生型球蟲對雞增重和盲腸病變的影響及致死率見表2。數據顯示，兩種球蟲200～1 000個孢子化卵囊/只劑量組感染雞的增重與空白對照組相比差異不顯著，高劑量組差異顯著（10 000～50 000個孢子化卵囊/只），但是兩種球蟲相同劑量組間增重差異不顯著。盲腸病變分和死亡率方面，二者也存在一定差異，尤其是轉基因球蟲致死率明顯高于野生型球蟲。

表2 轉基因球蟲和野生型球蟲對雞的致病性

免疫原性試驗結果見表3。數據顯示，轉基因球蟲和野生型球蟲各感染組雞增重與空白對照組相比差異不顯著，與不感染攻毒組相比差異顯著。各感染組間盲腸卵囊數量盡管存在差異，但與不感染攻毒組相比均呈顯著差異，且各感染組無1只雞死亡，說明轉基因球蟲和野生型球蟲一樣具有良好的免疫原性。

表3 轉基因球蟲和野生型球蟲對雞的免疫原性

3 討論

通過相關文獻資料可知，艾美耳球蟲卵囊形態大小具變異的可能性，最小潛在期亦存在株間差異［3－5，9－14］。林瑛（1998）指出，建立 1個株的初次純種分離（或單卵囊分離）的時機對球蟲的潛在期會有很大影響，如果初次分離是在感染雞的排卵囊初期，則這些球蟲的后代會像其原代一樣，潛在期較短；反之，初次分離時已過排卵囊高峰期或在排卵囊末期，則這些球蟲的后代潛在期會相對較長［11］。球蟲卵囊產量的多少與多種因素密切相關，包括感染蟲株種類、感染劑量和 雞的品 種、年齡等［5，10，15－16］。已知轉基因球蟲是經過單孢子囊篩選后獲得的子代卵囊，篩選具隨機性，選取的卵囊在排卵囊期的時間點不確定，如果挑選的是排卵囊初期的卵囊，則其無論大小還是最小潛在期等都會與排卵囊后期的卵囊存在一定差異。因此推斷單孢子囊篩選是引起轉基因球蟲和野生型球蟲株間差異的主要原因。

眾所周知，柔嫩艾美耳球蟲的所有發育階段只在盲腸或盲腸附近的腸組織內完成，通常不會對除了雞以外的其他動物構成威脅［3，5］。轉基因球蟲亦具備這種生物學特點，且高劑量感染時只寄生于雞的盲腸組織，亦不感染小鼠和家鴿。但在致病性和免疫原性方面轉基因球蟲又與野生型球蟲存在一定的差異，主要表現在死亡率和免疫后抑制卵囊產量上。Long（1973）指出，分離到的同一種蟲體或蟲株其毒力不同；Dikovskata（1974）也報道，不同地區13株柔嫩艾美耳球蟲的致病力不同，這些蟲株間感染雞的死亡率變動范圍大（12.5%～80%），并且轉基因球蟲的死亡率與等劑量感染時我國某山西株的死亡率接近，因此研究中轉基因球蟲和野生型球蟲死亡率之間表現的差異也不足為奇［3，17］。另外，Shirley等（1996）用核酸探針雜交技術證實，以單個孢子囊感染雞所得的后代群體是遺傳性狀完全一致的克隆群體，也即是說研究中使用的轉基因球蟲遺傳性狀單一，因此其在免疫原性試驗中表現的抑制卵囊產量弱于野生型球蟲的結果也是不難理解的。

綜上所述，轉基因球蟲與野生型球蟲間表現的部分差異應是艾美耳球蟲株間差異的體現，盡管二者存在一定的差異，但是它們的生物學特性仍然具有較高的相似性，且符合柔嫩艾美耳球蟲生物學特性。這里還需要提及的是，轉基因球蟲與野生型球蟲在致病性方面表現的差異在實驗室獲得的另一株轉基因球蟲上亦有體現［18］。因此，綜合分析得出，轉基因球蟲研制成功后可考慮在卵囊排出顯露期的不同時間點進行單孢子囊篩選，各自獲得子代卵囊后再混合使用，以增加轉基因球蟲的遺傳多樣性，降低與受體的差異。

［1］ 索勛，王曉佳，劉賢勇，等.球蟲的新用途：中國，200710－064924.8［P］.2010－08－18.

［2］ Suo X，Wang X，Liu X，Shi T，etal.球蟲的新用途：中國，US8，142，771B2［P］.2012－03－28.

［3］ 彼得L·朗.球蟲生物學［M］.蔣金書，劉鐘靈，陸信武，譯.南寧：廣西科學技術出版社，1990.

［4］ 孔繁瑤.家畜寄生蟲學［M］.2版.北京：中國農業大學出版社，1997.

［5］ 索勛，李國清.雞球蟲病學［M］.北京：中國農業大學出版社，1998.

［6］ Haug A，Williams R B，Larsen S.Counting coccidial oocysts in chicken faeces：a comparative study of a standard McMaster technique and a new rapid method［J］.Veterinary Parasitology，2006，136（3－4）：233－242.

［7］ Norton C C，Chard M J.The oocyst sporulation time of Eimeria species from the fowl［J］.Parasitology，1983，86（2）：193－198.

［8］ Johnson J，Reid W M.Anticoccidial drugs：lesion scoring techniques in battery and floorpen experioments with chickens［J］.Exp Parasital，1970，28：30－36.

［9］ Jeffers T K.Attenuation of Eimeria tenella through selection for precociousness［J］.The Journal of parasitology，1975，61（6）：1083－1090.

［10］韓靜芳，董輝，黃兵，等.雞球蟲早熟株的選育及孢子化卵囊大小測定［A］.中國畜牧獸醫學會家畜寄生蟲學分會第九次學術討論會論文摘要集［C］.長春：中國畜牧獸醫學會家畜寄生蟲學分會，2006：55.

［11］Long P L，Johnson J K.Eimeria of American chickens：characterstics of six attenuated strains produced by selection for precocious development［J］.Avian Pathology，1988，17：305－314.

［12］段嘉樹，張翠紅，郭榮華，等.柔嫩艾美爾球蟲和毒害艾美爾球蟲早熟弱毒株的致病性和免疫原性研究初報［J］.當代畜牧，1993，4：21－23.

［13］王仲兵，古少鵬.柔嫩艾美耳球蟲的分離鑒定與致病性測定［J］.中國動物檢疫，2010，27（9）：36－38.

［14］林瑛，徐衛東.雞球蟲潛隱期影響因素分析［J］.遼寧畜牧獸醫，1998，1：29－30.

［15］段嘉樹，李秋明，于占芳.不同日齡雛雞對柔嫩艾美球蟲早熟株卵囊的易感性及免疫力［J］.中國獸醫科技，1999，29（1）：9－10

［16］段嘉樹，李秋明，William Wong.The Influence of Host Age on the Infectivity of Precocious lines of Eimeria and the Clinical Immunity in chicks［J］.Acta Parasitol Med Entomol Sin，2001，8（3）：135－139.

［17］古少鵬，韓春來，鄭明學，等.柔嫩艾美耳球蟲山西分離株的分離與致病性觀察［J］.寄生蟲與醫學昆蟲學報，2008，15（2）：65－69.

［18］閆文朝，王天奇，索勛，等.表達黃色熒光蛋白和乙胺嘧啶抗性基因的轉基因柔嫩艾美耳球蟲的發育和致病性分析［J］.畜牧獸醫學報，2009，40（12）：1794－1798.