重組大腸桿菌KO11利用單糖發酵乙醇條件優化*

王浩襲，王鵬，王靜，牟海津

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島，266003)

隨著化石能源的枯竭與環境污染的加劇，尋找替代能源是解決人類能源問題的必經之路。生物乙醇是可再生能源，比化石能源更清潔［1］，其生產原料來自淀粉質、糖質、纖維質等。目前生物乙醇主要使用玉米、甘蔗渣等為原料，但用其生產的乙醇成本高，并會產生食品安全威脅，限制了生物乙醇的發展［2］。纖維質來源廣泛，價格低廉，具有生產生物質乙醇的巨大潛力，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質素［3］，以及少量果膠、灰分等［4］。纖維素最終水解產物為葡萄糖，半纖維素水解后主要得到木糖［5］和少量的甘露糖、半乳糖、鼠李糖等還原糖。如果將半纖維素降解的糖發酵生成乙醇，可提高纖維燃料乙醇轉化率［6］。有些自然界的細菌能發酵五碳糖，但其發酵產物中乙醇僅占很小比例［7］，如大腸桿菌(Escherichia coli)含有代謝戊糖的磷酸戊糖途徑的整套基因與酶，可以代謝戊糖與己糖，但乙醇產量很低。Ohta等［8］利用Zymomonas mobilis中的pdc與adhB基因構建pet(production of ethanol)操縱子，導入到 E.coli中，得到能夠同時高效利用葡萄糖與木糖的重組大腸桿菌KO11，是發酵混合糖的理想菌株［9］。為了對KO11進行更好的利用，本實驗重點從溫度、pH、振蕩方式等方面對KO11的發酵條件進行了優化，將其利用碳源情況與酵母菌進行了比較，并研究了其發酵混合糖情況與糖濃度耐受性，可為纖維素和半纖維素的乙醇共發酵提供工藝指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

重組大腸桿菌E.coli KO11(以下簡稱KO11)，購買自 ATCC○R55124(American Type Culture Collection);酵母AN1#(Saccharomyces cerevisiae，以下簡稱AN1#)，本實驗室保存。

1.1.2 培養基

固體培養基:LB固體培養基，葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.0，氯霉素40 mg/L;PDA固體培養基，土豆200 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂 15 g/L。

液體培養基:LB培養基，糖20 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母膏 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0;酵母培養基，糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，NH4Cl 2 g/L。

培養基均采用115℃滅菌30 min。

1.1.3 儀器

雷磁pHS－25數顯pH計，上海精密科學儀器有限公司;UV－2000型可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;SBA－40C生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所;DNP－9052型電熱恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司;HZQ－C型空氣浴振蕩器，哈爾濱市東明醫療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與種子液準備

KO11與AN1#接種于新鮮斜面后分別在35℃與30℃培養24 h，活化3次后取一環轉接入液體培養基中，分別在35℃與30℃，150 r/min振蕩培養12～14 h，得到種子液。

1.2.2 發酵

發酵均在250 mL錐形瓶中進行，每瓶裝液量100 mL。接種4%(v/v)預先培養好的種子液，KO11于35℃、AN1#于30℃，150 r/min振蕩培養，定時取樣檢測。實驗均為3個平行。

1.2.3 測定方法

菌體生物量采用OD 600 nm比濁度法［10］測定;還原糖含量采用3，5－二硝基水楊酸比色定糖法(DNS 法)［11］測定;乙醇含量測定采用 SBA－40C 生物傳感分析儀。乙醇轉化率計算公式如下［12］:

2 結果與討論

2.1 KO11與AN1#酵母的生長、乙醇產量與糖利用比較分析

將KO11與AN1#接種于以葡萄糖、木糖為碳源的液體培養基中，分別于35℃與30℃振蕩培養，定時取樣測定細胞生長情況、乙醇含量與殘糖量，繪制相應曲線，結果見圖1。

從圖1(A)可知，KO11振蕩培養至5 h時開始進入對數生長期，大約14 h時生長速度開始減慢，進入穩定期，因此KO11培養至10～14 h是最佳接種期;AN1#從7 h左右進入對數生長期，15 h進入穩定期，AN1#適應期較長，但增殖迅速;糖含量的變化與菌體生長情況聯系緊密，菌體進入對數生長期前糖含量有少量消耗，進入對數生長期后即被迅速消耗，當被消耗殆盡后菌體沒有充足的營養來源提供其生長繁殖，即進入衰退期;2株菌的乙醇轉化曲線相似，在菌體進入對數期后即迅速增長，其中KO11在24 h達到最高值840 mg，乙醇轉化率為82.35%，AN1#在26 h達到最高產值850 mg，乙醇轉化率為83.33%，之后均略有下降，因此24、26 h分別為KO11、AN1#發酵葡萄糖產乙醇的理想測量時間點。從圖1(B)可以看出，KO11利用木糖的菌體生長曲線相對于葡萄糖的略微滯后，8 h進入對數期，23 h進入穩定期;27 h轉化木糖生成780 mg乙醇，達到最大乙醇轉化率為84.78%，與利用葡萄糖的乙醇轉化率相似;KO11對木糖的利用速度較慢，33 h以后才基本消耗完全;AN1#不能利用木糖轉化生產乙醇，并且其菌體濃度一直維持在非常低的水平，無法大量增殖。

這些結果表明，KO11在發酵纖維質水解產物產乙醇的工藝中比酵母菌更有潛力。

圖1 KO11與AN1#分別以葡萄糖(A)、木糖(B)為碳源時菌體濃度、乙醇產量與殘糖量隨時間變化情況Fig.1 Changes of the cell concentration，ethanol yield and residual sugar based on glucose(A)and xylose(B)by KO11 and AN1#

2.2 KO11利用不同單糖發酵產乙醇

雖然將纖維質原料轉化為生物乙醇具有很大的潛力，但是要想實現工業化生產，還有很多瓶頸問題亟需解決，例如缺乏能夠同時高效利用纖維素類水解物(主要是葡萄糖與木糖)的發酵菌株，成為制約纖維素乙醇生產的關鍵因素之一，因此構建高效的基因工程菌成為了研究熱點。通過基因重組得到的E.coli KO11能夠利用葡萄糖與木糖發酵產乙醇，對發酵液中的抑制物也有相對高的耐受性［13］。為了更全面分析其對單糖的乙醇轉化能力，本實驗分別向含有不同種類還原糖(初始糖濃度均為20 g/L)的LB培養基中接種KO11種子液，于35℃振蕩培養，發酵結束后取樣測定乙醇轉化率與糖殘留率，結果如圖2所示。可以看出，KO11分別以巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖為碳源發酵時，24 h的乙醇轉化率能夠達到 66.49%、15.49%、76.53%、78.10%、84.78%、82.35%，糖利用率除鼠李糖外均達到90%以上，并且糖殘留率大小與乙醇轉化率趨勢呈負相關性;48 h時雖然各種糖殘留率均有下降，但是除鼠李糖組以外其他各組的乙醇轉化率也開始下降，導致乙醇產量的損失。其中，KO11在24 h時利用木糖與葡萄糖發酵的乙醇轉化率達到80%以上，利用半乳糖與甘露糖的乙醇轉化率稍低，達到75%以上，利用巖藻糖的則高于65%。鼠李糖能夠被KO11利用進行代謝，但是不能被很好轉化為乙醇，相反，其他5種糖則可以被高效轉化為乙醇，尤其是在纖維質中的主要組成單位葡萄糖與木糖，葡萄糖能夠在24 h基本被利用完。相比于大多數乙醇發酵菌種，KO11能夠利用多種還原糖進行乙醇轉化，具有較好的轉化生物乙醇的潛力。

圖2 KO11在24 h與48 h利用單糖的乙醇轉化率與糖殘留率Fig.2 Ethanol production rate and sugar consumption rate by strain KO11 at 24 h and 48 h

2.3 pH對KO11發酵乙醇的影響

E.coli的 pH值適應范圍狹窄而中性(6.0～8.0)［14］，可能在適應性方面成為其基因改造后的缺陷。為揭示不同pH值對KO11發酵糖產乙醇的影響，本文采用添加不同pH值的磷酸鹽緩沖液的方式調節發酵液pH值，對KO11發酵性能進行考察。配制0.2 mol/L不同pH值的磷酸鹽緩沖液，10倍稀釋加入發酵液中。不同pH值對KO11利用葡萄糖(發酵24 h)、木糖(發酵27 h)轉化乙醇的影響情況見圖3，可以看出KO11乙醇轉化率受發酵液pH值的影響明顯:加入pH 5.5的緩沖液組KO11的乙醇轉化率均為最高，分別達到88.39%與88.11%。葡萄糖為底物時，乙醇轉化率隨著pH值的升高而降低，當pH為7.5時，乙醇轉化率僅有77.36%;木糖為底物時，乙醇轉化率在pH為6～7時較接近，繼續升高pH到7.5時乙醇轉化率較大幅度降低至79.43%。圖中糖利用率的曲線說明97%以上的糖能夠被KO11利用，糖利用率隨著pH值的升高而升高，不過利用率的升高并沒有導致乙醇轉化率的升高。纖維質的糖化效率是發酵乙醇的關鍵環節，很多商品酶的最適pH介于5～6［15］，選擇pH 5.5有利于將KO11發酵條件與酶解更好銜接。

圖3 pH對KO11利用葡萄糖、木糖產乙醇的影響Fig.3 Effect of pH on ethanol production by strain KO11 based on glucose and xylose

2.4 溫度對KO11發酵乙醇的影響

向添加pH 5.5緩沖液的發酵培養基中接種KO11，于不同溫度下振蕩培養，結束后取樣分析乙醇轉化率。結果如圖4所示。KO11最適發酵溫度為37℃，與文獻報道一致［16］，發酵葡萄糖的乙醇轉化率最高達到90.55%，發酵木糖的乙醇轉化率最高達到90.12%。溫度繼續升高，乙醇轉化率開始下降，至43℃時，乙醇轉化率分別能達到79.88%(葡萄糖)、80.07%(木糖)，表明KO11在43℃以內具備較高的乙醇轉化能力，有一定的耐高溫發酵性能，但繼續升溫至45℃時乙醇轉化率明顯下降。糖的利用率與乙醇轉化率的趨勢相同，在37℃達到最大，當溫度超過43℃后明顯下降。在同步糖化發酵過程中，由于發酵菌種的最適溫度與酶的最適溫度存在差異，從而影響酶的糖化效率［17］，較低的發酵溫度會抑制酶活，導致發酵時間的延長［18］，因此，篩選耐高溫菌種可以在一定程度上解決酶的最適溫度與發酵溫度不協調的矛盾［19］。一般乙醇發酵菌種的發酵溫度低于40℃，如Kadam等報道40℃時用釀酒酵母發酵稀H2SO4預處理的白楊木時，只有73%的乙醇轉化率，具有耐高溫特點的Candida acidothermophilum的乙醇轉化率則能夠達到80%［20］。

圖4 不同溫度對KO11利用葡萄糖、木糖產乙醇的影響Fig.4 Effect of temperature on ethanol production by strain KO11 based on glucose and xylose

2.5 振蕩方式對KO11發酵乙醇的影響

一定的溶氧量有利于菌體的生長與代謝，實驗室往往采用一定轉速的振蕩方式提供氧氣，并提高菌體與碳源接觸的均勻程度，但過量氧氣也會導致菌體過度生長，消耗大量底物，從而降低乙醇的產量。乙醇發酵的代謝方式為厭氧代謝，氧氣的增加可能會導致碳源代謝流向的改變，為了使產物合成速率與比速率達到最大值，需要維持呼吸臨界溶氧濃度［21］。本實驗通過改變連續振蕩時間控制供氧量，考察對KO11乙醇發酵的影響。向添加pH 5.5磷酸緩沖液的培養基中接種KO11，于37℃振蕩培養不同時間后取出靜置于37℃恒溫培養箱，每隔一定時間取樣分析乙醇轉化率與殘糖量，結果如圖5所示。從圖5(A)可以看出，以葡萄糖為碳源時，振蕩4 h后靜置組在24 h(振蕩4 h，靜置20 h)可達到最高產率94.81%，振蕩6 h后靜置組與振蕩8 h后靜置組比前者略低，振蕩12 h后靜置組則產率偏低，說明較多溶氧對KO11利用葡萄糖進行乙醇發酵不利;葡萄糖利用率曲線顯示，靜置組的糖利用較慢，到48 h時尚未利用完全，振蕩4 h后靜置組與振蕩6 h后靜置組在24 h時將糖利用完，振蕩8 h后靜置組與振蕩12 h后靜置組則在12 h時即將葡萄糖利用完，說明振蕩時間的延長可以明顯促進菌體對葡萄糖的利用，但乙醇產量會隨振蕩時間的延長先增大后減少，只有提供合適的溶氧量才能將糖有效地轉化為乙醇，因此不可盲目延長振蕩時間。從圖5(B)可以看出，發酵木糖時，隨著振蕩時間的延長，各組的最高乙醇轉化率不斷升高，振蕩12 h后靜置組在27 h得到了最高乙醇轉化率94.15%，此時木糖基本被完全利用，繼續延長振蕩時間并不會有明顯提高。KO11對木糖的利用速度明顯比對葡萄糖的利用速度慢，需要更長的振蕩時間來提高生物量，從而提高木糖利用率。實驗結果表明到27 h時只有振蕩12 h后靜置組能夠將木糖利用完全，說明KO11利用木糖產乙醇需要更長振蕩時間。無論利用葡萄糖還是木糖發酵，靜置組的糖利用速度都很慢，導致乙醇轉化率也很低，說明發酵初始階段為菌體的增殖提供氧氣是必要的。

此結果可為利用KO11發酵含有木糖與葡萄糖的纖維質降解產物的實驗提供參考，結合發酵液中碳源的情況選擇合適的振蕩時間。

2.6 KO11發酵混合糖產乙醇

Grootjen等［22］研究發現 Pichia stipitis和 S.cerevisiae在發酵葡萄糖與木糖混合糖時，菌種對木糖的乙醇轉化能力受到葡萄糖濃度的影響很大，當葡萄糖濃度大于2.3 g/L時會明顯抑制菌種對木糖的利用。由圖6可知，葡萄糖對木糖發酵的確有一定程度的影響。0～16 h葡萄糖濃度大于4 g/L時，木糖僅利用了不到10%;16 h以后木糖開始被利用，從乙醇含量曲線可看出24 h時出現了拐點，葡萄糖利用完畢后KO11開始快速利用木糖，到48 h基本將木糖利用完全。KO11發酵混合糖時會優先利用葡萄糖轉化乙醇，當葡萄糖濃度低于4 g/L時，木糖開始被明顯利用，因此進行共發酵時需要選擇合適的發酵工藝來緩解葡萄糖對木糖發酵的抑制作用。

2.7 KO11對糖濃度耐受性

追求盡量高的乙醇產量意味著需要不斷追求更高的酶解率以提高糖濃度，但是在提高酶解液糖濃度的同時，也可能對微生物的新陳代謝產生不利影響［24］。過高濃度的糖液產生的高滲透壓環境可能導致微生物不能生長代謝。因此需要對KO11的糖濃度耐受性進行考察。

將KO11接種于分別含有2%、5%、10%的初始葡萄糖濃度的發酵培養基中，于最佳條件下培養，定時測葡萄糖與乙醇含量，考察菌種對不同濃度葡萄糖的利用情況。結果如圖7所示。由圖可知，KO11在2%、5%的糖濃度下分別在24、32 h得到92%左右的乙醇轉化率，在10%糖濃度下到60 h仍在緩慢增加，但是已經趨近最大，達到67%左右。結果表明，隨著發酵液初始糖濃度的增大，KO11利用糖的時間延長，發酵時間也隨之延長，在糖濃度5%以下KO11利用糖轉化乙醇的能力相近，糖濃度增大到10%時，雖然能夠將糖利用完全，但是乙醇轉化率明顯降低。

圖5 不同振蕩方式對KO11利用葡萄糖(A)、木糖(B)產乙醇的影響Fig.5 The effect of various agitating ways on ethanol production by strain KO11 based on glucose and xylose，respectively

圖6 KO11利用混合糖(1.5%葡萄糖+0.5%木糖)時乙醇轉化能力Fig.6 Ethanol conversion ability to utilize mixture sugars(1.5%glucose+0.5%xylose)by KO11

圖7 KO11利用不同濃度葡萄糖(2%、5%、10%)的乙醇轉化率Fig.7 Ethanol production rate fermented different concentration of glucose(2%，5%，10%)by KO11

3 結論

提高發酵乙醇轉化率、擴大適用底物種類、更好銜接原料降解與發酵環節是利用纖維質進行生物乙醇轉化的關鍵技術環節之一。本文通過對KO11發酵單糖條件的優化，對該菌種進行了更深入的研究，得出結論如下:(1)除葡萄糖與木糖外，KO11還能夠高效利用巖藻糖、甘露糖、半乳糖發酵產乙醇，說明其與傳統的酵母菌相比，具有更高的乙醇利用率;(2)KO11以葡萄糖為碳源時，在37℃，pH 5.5，150 r/min振蕩4 h后靜置發酵，在24 h能夠得到最高乙醇轉化率94.81%，以木糖為碳源時，在相同的溫度、pH值、振蕩速度下發酵12 h后靜置，在27 h能得到最高乙醇轉化率94.15%，KO11在43℃時仍具有較高的乙醇轉化能力，可以在同步糖化發酵方式中提高體系溫度，提高酶解效率，節約酶的使用量;(3)混合糖發酵時，KO11優先利用葡萄糖;(4)KO11有較高的糖耐受性，可以在高濃度酶水解液中發酵產乙醇。雖然目前利用運動發酵單孢菌(Z.mobilis)與大腸桿菌(E.coli)中構建木糖代謝途徑的研究已取得顯著進展，但在距離實際生產應用仍有較大差距。未來的菌種研究方向可以在以下幾方面做出更大努力:通過基因改造獲得更優良的纖維素水解酶生產菌種和戊糖發酵菌種，以及能夠將生產酶與發酵結合起來的菌種，建立CBP工藝技術體系;進一步通過現代生物技術等手段提高菌種的乙醇耐受能力、纖維素水解物抑制物耐受能力(如呋喃甲醛等)、溫度適應性和pH適應范圍等。

［1］Hahn－H?égerdal B，Lindén T，Senac T，et al.Ethanolic of fermentation of pentoses in lignocellulose hydrolysates［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，1991，28(29):131－144.

［2］孫玉英，譚海剛，張繼泉，等.發酵木糖酵母菌株的選育［J］.廣州食品工業科技，2002，18(4):1－4.

［3］Edwards M C，Doran－Peterson J.Pectin－rich biomass as feedstock for fuel ethanol production［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2012，95:565－575.

［4］Mosier N，Wyman C，Dale B，et al.Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass［J］.Bioresource Technology，2005，96(6):673－686.

［5］Gong C S，Cao N J，Du J，et al.Ethanol production from renewable resources［J］.Advances Biochemical Engineering/Biotechnology，1999，65:207－241.

［6］曹秀華，阮奇城，林海紅，等.纖維燃料乙醇生產中木糖發酵的研究進展［J］.中國麻業科學，2010，32(3):166－182.

［7］孫金鳳，王正祥.新型產乙醇重組菌利用葡萄糖和木糖的乙醇發酵［J］.食品與發酵工業，2008，34(5):105－109.

［8］Ohta K，Beall D S，Mejia J P，et al.Genetic improvement of Escherichia coli for ethanol production:chromosomal integration of Zymomonas mobilis genes encoding pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase II［J］.Applied and Environmental Microbiology，1991，57(4):893－900.

［9］賀應龍，熊興耀，蘇小軍.五碳糖發酵生產乙醇的菌種研究進展［J］.中國釀造，2010(4):8－11.

［10］齊小強，崔哲.高效發酵木糖重組酵母菌株YPH499－CZ發酵條件研究［J］.中國現代醫生，2010，48(15):11－17.

［11］Miller G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for the determination of reducing sugars［J］.Analytical Chemistry，1959，31(3);426－428.

［12］Li X，Kim T H.Bioconversion of corn stover derived pentose and hexose to ethanol using cascade simultaneous saccharification and fermentation(CSSF)［J］.Bioprocess and Biosystems Engineering，2012，35(1/2):99－104.

［13］何明雄，祝其麗，潘科，等.利用木質纖維素類生物質發酵生產乙醇重組菌株研究進展［J］.應用與環境生物學報，2009，15(4):579－584.

［14］王靖，安明泉.木糖發酵菌種研究進展［J］.化學與生物工程，2007，24(11):1－4.

［15］Kim N J，Li H，Junk K，et al.Ethanol production from marine algal hydrolysates using Escherichia coli KO11［J］.Bioresource Technology，2011，102(16):7 466－7 469.

［16］Rorick R，Nahar N，Pryor S W.Ethanol production from sugarbeet pulp using Escherichia coli KO11 and Saccharomyces cerevisiae［J］.Biological Engineering，2011，3(4):199－209.

［17］Alani F，Gallifuoco A，Saporosi A，et al.Comparison of SHF and SSF processes for the bioconversion of steam－exploded wheat straw［J］.Industrial Microbiology and Biotechnology，2000，25(4):184－192.

［18］Suryawati L，Wilkins M R，Bellmer D D，et al.Simultaneous saccharification and fermentation of kanlow switchgrass pretreated by hydrothermolysis using Kluyveromyces marxianus IMB4［J］.Biotechnology and Bioengineering，2008，101(5):894－902.

［19］李科，靳艷玲，甘明哲，等.木質纖維素生產燃料乙醇的關鍵技術研究現狀［J］.應用與環境生物學報，2008，14(6):877－884.

［20］Kadam K L，Schmidt S L.Evaluation of Candida acidothermophilum in ethanol production from lignocellulosic biomass［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1997，48(6):709－713.

［21］施慶珊，陳儀本，歐陽友生.影響發酵過程中氧利用效率的一些因素［J］.發酵科技通訊，2008，37(1):43－46.

［23］Grootjen DRJ，Jansen m L，et al.Reactors in series for the complete conversion of glucose/xylose mixtures by Pichia stipitis and Saccharomyces cerevisiae［J］.Enzyme Microbiology Technology，1991，13(10):828－833.

［24］沈萍.微生物學［M］.北京:高等教育出版社，2000.80－81.