耐氟康唑光滑念珠菌耐藥機制研究

張 煒， 應春妹

(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科，上海200127)

侵襲性念珠菌引起的深部真菌感染的上升，已經成為一個嚴重的公共健康問題［1］。隨著免疫抑制劑在臨床的廣泛使用，免疫缺陷人群的增多尤其是獲得性免疫缺陷綜合征患者的增加，目前白念珠菌在臨床的分離率有所下降，而非白念珠菌，尤其是光滑念珠菌等引起的感染明顯增加［2］。由于光滑念珠菌對常用抗真菌藥物包括兩性霉素B的敏感性低，且對三唑類抗真菌藥物的最低抑菌濃度值偏高，可對三唑類藥物原發耐藥，也可出現繼發耐藥。耐藥的發生是一個多水平、多因素參與的復雜過程。念珠菌對唑類藥物耐藥機制的研究已經成為當今醫學研究的熱點，但國內目前在念珠菌耐藥性尤其是光滑念珠菌耐藥性方面的研究仍然較少。因此，我們采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)對光滑念珠菌臨床分離株ERG11、CDR1和CDR2基因表達的mRNA進行相對定量，從而探討基因表達與耐藥之間的關系。

材料和方法

一、材料

1.試驗菌株 光滑念珠菌臨床菌株共22株，其中對氟康唑耐藥11株(編號分別為NSG-1、DF-1、DF-2、DF-3、DF-5、DF-7、DF-8、DF-10、DF-17、DF-18、DF-20)、劑量依賴性敏感 3 株(EME-1、SUR-2、SIC-1)、敏感 8 株(NSG-7、NSG-3、NSG-4、SUR-1、RES-2、WFF-1、SIC-2、OST-1)，均由仁濟醫院檢驗科鑒定并保存。試驗菌株藥物敏感性分析方法及結果判定參考文獻［3］。質控菌株為近平滑念珠菌(ATCC 22019)和克柔念珠菌(ATCC 6258)，由瑞金醫院盧灣分院檢驗科惠贈。

2.主要試劑與儀器 Trizol試劑 (美國Invitrogen公司);DEPC(北京鼎國昌盛公司);氯仿、異丙醇、無水乙醇(上海化學試劑公司);反轉錄試劑 (美國 Fermentas公司);Realtime試劑(瑞士Roche公司);RNA free水 (日本Takara公司);熒光定量PCR儀 (美國ABI公司);核酸蛋白分析儀 (德國Eppendorf公司)。

3.引物 擴增光滑念珠菌 CDR1、CDR2、ERG11基因以及actin編碼基因(ACT1)的引物均使用Primer 5.0軟件進行設計。所有引物均由Invitrogen公司合成。具體引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物

二、方法

1.試驗菌株總RNA提取 首先挑取活化后的單個菌落接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養基中30℃振蕩培養過夜，用細胞計數板調整菌液濃度至(5～10)×106個/mL;再取1mL菌液離心收集細胞，用焦碳酸二乙酯水洗滌2次;然后按照Trizol試劑說明提取試驗菌株總RNA，最后加入適當體積30～50μL RNA free水，充分溶解。取適量樣本1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并分別取1μL樣本測定吸光度(A)260nm/A280nm值，其余分裝，－70℃保存。

2.逆轉錄PCR 在冰上配制逆轉錄反應液，先采用11μL總體積(10×緩沖液1μL;脫氧核糖核酸酶1μL;RNA樣本4μg;RNA free水補足至11μL)，37℃ 30 min;然后加入終止緩沖液(Stop solution)和胸腺嘧啶寡聚核苷酸Oligo(dt)各1μL，75℃ 5 min，冰上退火5 min，離心2～3 s;最后加入5*Moloney小鼠白血病病毒緩沖液5μL，dNTP5μL，核糖核酸酶抑制劑1μL，Moloney小鼠白血病病毒1μL，總體積25μL，42℃1h，70℃ 10min，冰上退火得cDNA。

3.實時PCR PCR反應體系(25μL):SYBR Green PCR預混液12.5μL、引物(10μmol/L)各2.5μL、cDNA 模板 2.5 μL、dH2O5.0μL。反應條件:50℃2min，95℃10min;95℃15s，60℃60s，共40個循環。

三、統計學方法

每一樣本重復3次，求其平均Ct值(即每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數)。依據Livak等［4］設計的一種比較閾值法來測定目的基因的相對表達量，目的基因的量表示的是試驗組目的基因的表達相對與對照組的變化倍數。

通過R(2.15.2)軟件進行數據處理和分析，數據用中位數(M)和四分位數(P25～P75)表示，用W:lcoxon軼和檢驗進行顯著性檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、逆轉錄PCR產物的確定分析

紫外分光光度計測定RNA在260和280 nm波長A值，A260nm/A280nm均在1.8～2.0，且RNA電泳結果顯示 RNA完整性好，說明所提取真菌RNA質量較好。ERG11、CDR1、CDR2以及 ACT1基因均可見擴增曲線呈現典型的S型熒光定量動力學曲線，溶解曲線為單一波峰、形狀銳利，說明試驗中未出現污染、引物二聚體和非特異性擴增。

二、耐藥組與敏感組多個耐藥基因mRNA表達水平差異

將22株臨床光滑念珠菌分為耐藥組、劑量依賴性敏感組和敏感組，不同組 CDR1、CDR2和ERG11基因mRNA表達差異見表2和圖1～3。CDR1基因在耐藥組與敏感組以及劑量依賴性敏感組與敏感組之間差異均有統計學意義(W=88、24，P均＜0.01);CDR2基因在耐藥組與敏感組以及劑量依賴性敏感組與敏感組之間差異存在統計學意義(W=71、24，P均＜0.05);ERG11 基因在耐藥組與敏感組以及劑量依賴性敏感組與敏感組之間差異也有統計學意義(W=82、24，P均＜0.05)。

表2 不同組CDR1、CDR2和ERG11基因mRNA表達的差異 ［M(P25～P75)］

圖1 光滑念珠菌耐藥組、劑量依賴性敏感組及敏感組CDR1基因表達量比較

圖2 光滑念珠菌耐藥組、劑量依賴性敏感組及敏感組CDR2基因表達量比較

圖3 光滑念珠菌耐藥組、劑量依賴性敏感組及敏感組ERG11基因表達量比較

討 論

由于獲得性免疫缺陷綜合征發病率增高，免疫抑制劑、廣譜抗菌藥物和糖皮質激素的大量應用，器官移植術、外科侵襲性操作及腫瘤放化療的不斷發展，使得深部真菌感染發病率不斷升高。目前光滑念珠菌已成為僅次于白念珠菌之后居于第2位的常見真菌感染病原體，且由于光滑念珠菌對唑類抗真菌藥物的最低抑菌濃度值趨于更高，且有些光滑念珠菌對抗真菌藥物存在固有的低敏感率，包括兩性霉素B［5］，造成感染后治療相當困難。Borst等［6］研究表明即使事先未使用唑類藥物治療，光滑念珠菌也會由于ATP結合轉運蛋白的表達增高而導致耐藥。

導致臨床光滑念珠菌對唑類抗真菌藥物耐藥的機制主要有:(1)唑類藥物作用的靶酶即羊毛甾醇14α-去甲基酶增加，導致三唑類藥物在光滑念珠菌細胞內必須有更高的濃度才能發揮其阻斷靶酶合成的作用;(2)藥物與羊毛甾醇14α-去甲基酶親和力下降;(3)真菌細胞內藥物外排能力增強而導致細胞體內無法積聚藥物，而與光滑念珠菌耐藥密切相關的ATP結合轉運蛋白是Cdr1p和Cdr2p，分別由CDR1和CDR2編碼;(4)因固醇Δ5，6-脫氫酶失活造成麥角固醇生物合成途徑失活。

部分試驗研究結果提示，CDR1、CDR2及ERG11的過度表達與光滑念珠菌耐藥性形成有關。本研究對該3種基因mRNA表達水平進行相對定量，發現耐藥菌株 CDR1、CDR2及ERG11基因的mRNA表達量均高于敏感株，且隨著對氟康唑耐藥程度增加而增加，提示試驗菌株CDR1、CDR2及ERG11基因表達上調可能是本研究中光滑念珠菌臨床分離株對氟康唑耐藥的主要分子機制。這與多數文獻報道結果一致［7］。除此之外，我們還發現CDR1的表達水平明顯高于CDR2，提示不同基因在耐藥性形成中地位不同，CDR2基因在本研究所用菌株耐藥性形成中的作用較CDR1基因小，這與國外的研究結果一致。Sanglard等［8］研究發現敲除光滑念珠菌CDR2基因未導致其對唑類藥物敏感性的增加，而同時敲除CDR1和CDR2可使光滑念珠菌對唑類藥物敏感性上升50%并且不會出現耐氟康唑的突變株。因此，CDR2可能是依賴于CDR1發揮作用的，但本試驗中并未發現CDR1基因表達而CDR2不表達的情況。

綜上所述，光滑念珠菌CDR1、CDR2及ERG11基因的過表達是臨床分離菌株對氟康唑耐藥的主要分子機制，但光滑念珠菌耐藥的形成是一個多因素作用、多水平調節的復雜過程，單個耐藥基因或單一耐藥機制均不能完全解釋光滑念珠菌的所有耐藥現象，尚待在后續試驗中進一步研究。

［1］龔曉霖，儲怡星，范基農，等.真菌感染及其藥敏試驗方法［J］.檢驗醫學，2005，20(1):81-83.

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［3］鄭 冰，姚冬婷，應春妹，等.醫院感染光滑念珠菌耐藥性及流行病學分析［J］.檢驗醫學，2012，27(6):461-466.

［4］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method［J］.Methods，2001，25(4):402-408.

［5］Lockhart SR，Joly S，Pujol C，etal.Development and verification of fingerprinting probes for Candida glabrata［J］.Microbiology，1997，14(Pt 12):3733-3746.

［6］Borst A，Raimer MT，Warnock DW，etal.Rapid acquisition of stable azole resistance by Candida glabrata isolates obtained before the clinical introduction of fluconazole［J］.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(2):783-787.

［7］Niimi M，Nagai Y，Niimi K，etal.Identification of two proteins induced by exposure of the pathogenic fungus Candida glabrata to fluconazole［J］. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2002，782(1-2):245-252.

［8］Sanglard D，Ischer F，Bille J.Role of ATP-bindingcassette transporter genes in high-frequency acquisition of resistance to azole antifungals in Candida glabrata［J］.Antimicrob Agents Chemother，2001，45(4):1174-1183.