血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa基因多態(tài)性與血小板輸注療效的關系

顧 萍，王 靜，張 帆，姚如恩，傅啟華

(上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心檢驗科，上海200127)

血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa，又稱整合素αⅡbβ3，是血小板(PLT)膜上含量最多的膜糖蛋白，通常以復合物形式分布于PLT和巨核細胞表面，是PLT膜的主要受體。GPⅡb/Ⅲa基因的多態(tài)性構成不同的PLT血型，是造成PLT輸注無效的免疫性因素。

材料和方法

一、對象

98例單采PLT輸注患者均來自上海兒童醫(yī)學中心血液腫瘤科，2010年8月至2011年10月的血液病治療期間共輸注單采PLT 1 468袋，均為輸注單采PLT 3次以上且歷時半年以上。其中男59例，女39例，年齡5個月～16歲。患者來源為全國各地，江蘇、浙江、上海地區(qū)占大多數(shù)。對照組30例，均為非血液病患者，因PLT減少或術中輸注單采PLT 2次以下。

二、方法

1.標本采集 采集患者靜脈血標本，以0.109 mol/L檸檬酸鈉1∶9抗凝。標本為分2份，1份用于PLT抗體檢測，分離血漿于－20℃凍存，1周內檢測完畢;另 1份用于抽提 DNA，－80℃凍存。

2.單采PLT來源 單采PLT由上海市血液中心提供。使用Haemonetics MCS+全自動血液成份分離機采集健康獻血者PLT。每單位PLT容量約250 mL，含 PLT 約2.5×1011個。

3.試劑與儀器 TIANamp Blood DNA Kit試劑盒由北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)。引物設計參照 NCBI GenBank中 GPⅡb/Ⅲa基因(ITGA2B和ITGB)序列(序列號 NG008331)，由上海英駿生物技術有限公司合成，引物序列見表1。聚合酶鏈反應(PCR)擴增試劑由TaKaRa公司(大連寶生物)生產(chǎn)。PLT抗體檢測試劑盒(固相凝集法)及專用離心機由長春博德生物技術有限責任公司生產(chǎn)。PLT計數(shù)采用SYSMEX XS-800i全自動血液分析儀，配套試劑、校準品及質控品等均由Sysmex公司生產(chǎn)。

表1 GPⅡb/Ⅲa上的PLT抗原擴增引物序列

4.GPⅡb/Ⅲa基因多態(tài)性檢測 按試劑盒說明書要求，提取患者基因組DNA進行PCR擴增反應。反應總體積 25μL，包括患者 DNA 1 μL、Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL、10× 緩沖液2.5 μL、dNTP(10 mmol/L)2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、H2O 17.25 μL。擴增條件:95℃ 5 min，然后95℃變性30 s，56～62℃退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，30個循環(huán)后，72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿酶(上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品)純化后直接測序，所用儀器型號為ABI 3730 DNA測序儀。

5.PLT特異性及相關性抗體檢測 按試劑盒說明書采用固相凝集法檢測患者血漿中IgG型PLT抗體。

6.PLT輸注指征 患者PLT減少，有顱內出血、體表有出血點、紫癜、鼻衄、齦血、血尿、消化道出血等出血癥狀或/和PLT計數(shù)＜20×109/L伴或不伴出血癥狀。

7.PLT輸注療效評價 本研究采用輸注后24h PLT計數(shù)糾正增加指數(shù)(corrected count increment，CCI)作為評判依據(jù)。CCI=絕對增加數(shù)×體表面積/輸入PLT總數(shù)。輸注后24h CCI＞4.5為輸注有效，否則為輸注無效。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計。采用卡方檢驗進行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、GPⅡb/Ⅲa基因多態(tài)性檢測結果

對所有患者的GPⅡb的E26和GPⅢa的E3、E4、E10、E12 外顯子進行測序分析，并與Genbank(序列號NG008331)相比對，結果除GPⅡb的E26存在T18809G的變異外，其他外顯子未發(fā)現(xiàn)變異。T18809G變異導致Ⅱb基因編碼843位的異亮氨酸為絲氨酸所取代，產(chǎn)生I843S(Ile843Ser)多態(tài)性。此多態(tài)性形成了PLT特異性抗原(human platelet antigen，HPA)-3血型的3種基因型，即 HPA-3aa、HPA-3ab、HPA-3bb(圖1)。3種基因型的例數(shù)分別為31、46、21例。

圖1 HPA-3基因多態(tài)性產(chǎn)生的3種血小板血型

二、PLT特異性及相關性抗體檢測結果

PLT抗體包括由PLT HPA產(chǎn)生的PLT特異性抗體和由HLA、紅細胞抗原等共同抗原產(chǎn)生的相關性抗體。患者組PLT抗體陽性率為52.0%，明顯高于對照組(13.3%，P＜0.01)，見表2。說明PLT抗體在多次輸注PLT的血液科患者中明顯升高。3種HPA-3基因型之間PLT抗體陽性率無差異(P＞0.05)，說明HPA-3 3種基因型患者在多次輸注PLT后都會產(chǎn)生PLT抗體，相互間無區(qū)別。見表3。

表2 PLT抗體檢測結果

表3 3種HPA基因型產(chǎn)生PLT抗體的比較

三、PLT輸注效果評價

1 468袋PLT中有1 142袋輸注后24h CCI＞4.5，有效率為77.8%。PLT輸注的有效性在HPA-3的3個基因型中無明顯差異(P＞0.05)，其中HPA-3ab略高，見表4。對51例存在PLT抗體的患者中的21例做了PLT配合性輸注，共輸注單采 PLT 65袋，有效輸注54次，有效率為83.1%。

表4 PLT輸注療效在HPA-3基因型中的比較

討 論

PLT GPⅡb/Ⅲa復合物是由α和β以非共價鍵結合而組成的異二聚體蛋白，其編碼基因ITGA2B和ITGB3均位于染色體17q21～22上，以常染色體雙等位基因以共顯性模式控制。GPⅡb基因(ITGA2B)長17.2 Kb，含30個外顯子，編碼1 039個氨基酸。GPⅢa基因(ITGB3)長度為46 Kb，屬于單拷貝基因，含15個外顯子，編碼778個氨基酸。GPⅡb和GPⅢa上均有很高的多態(tài)性，除HPA-14w外，絕大多數(shù)是由相應PLT GP結構基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)引起，其多態(tài)性構成了人類PLT HPA，并表現(xiàn)為PLT獨特的遺傳多態(tài)性。

GPⅡb的第26外顯子上存在I843S和V837M 2個多態(tài)性，分別構成HPA-3和HPA-9血型。GPⅢa的第3、4、10、12外顯子上存在L33P、R143Q、R489Q、P407A、R636C、R62Q、R663H 多態(tài)性，構成 HPA-1、HPA-4、HPA-6、HPA-7、HPA-8、HPA-10和HPA-11共7個血型。

本研究通過對98例長期輸注PLT的血液病患者GPⅡb和GPⅢa的9個多態(tài)性位點的檢測，發(fā)現(xiàn)GPⅡb上存在I 843S多態(tài)性，即HPA-3aa、HPA-3ab和HPA-3bb 3個基因型，其余多態(tài)性未檢出。迄今為止，已有多篇文獻［1-7］報道了不同國家、不同地區(qū)、不同人群的HPA基因檢測頻率存在差異。我國漢族人群的HPA多態(tài)性大多集中在HPA-1～6和 HPA-15上，特別是 HPA-3和HPA-15，該二者的a、b等位基因頻率幾乎各占一半，其a/b抗原不配合幾率越高，在PLT輸注時刺激受者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生PLT抗體的幾率就越大，HPA-3尤為嚴重。本研究結果顯示，98例患者HPA-3的基因頻率趨勢與報道類似，因是收治的血液病患者而非普通人群調查，所以只能顯示大體趨勢。本研究未檢出多態(tài)性的HPA-4、7、8、9、10、11的aa型頻率在江蘇、浙江、上海地區(qū)漢族人群中均為100%［6］，HPA-1、6的 aa型頻率均＞98%。本研究的標本量相對較小，是未能檢出多態(tài)性的原因。

GPⅡb/Ⅲa基因多態(tài)性導致分子結構的空間構象發(fā)生改變，改變了其抗原性，調節(jié)了其表達水平，表面抗原構象的改變導致抗體的產(chǎn)生，進而影響PLT輸注的療效，出現(xiàn)輸注耐受現(xiàn)象。PLT抗體包括特異性抗體和相關性抗體，分別由HPA、共同抗原(包括 HLA和ABO、Lewis、P等紅細胞血型抗原)免疫刺激而產(chǎn)生。本研究結果顯示，98例患者長期輸注PLT后，有52%的患者產(chǎn)生PLT抗體，有效輸注率為77.8%。產(chǎn)生PLT抗體的患者并非每次輸注隨機的PLT都無效，本研究結果顯示，HPA-3ab型患者輸注有效率最高(78.9%)，aa 型 居 中 (77.2%)，bb 型 最 低(76.3%)。這種情況可能與獻血員的PLT血型有關。如aa型患者數(shù)量多于bb型，根據(jù)基因頻率，此型獻血員數(shù)量也應該多于bb型，而ab型患者可接受aa、bb和ab 3種基因型的PLT，這些因素可能是造成aa型和ab型患者PLT輸注有效率略高的原因。此外，PLT相關抗體中的HLA抗體對PLT輸注效果影響很大，故HPA-3ab型患者并非每次輸注都有效，而且21例有抗體的患者輸注65袋配合型的PLT后，療效僅為83.1%。HPA抗體最易產(chǎn)生，但由于HLA更具多態(tài)性，因此HLA抗體更常見。機體產(chǎn)生的HLA抗體往往具有多特異性。當HLA抗體合并HPA抗體時，PLT輸注無效更易發(fā)生。HLA抗體數(shù)量占主要地位，其次為HPA抗體［8-9］。故PLT抗體是造成輸注無效的免疫性原因，PLT GP多態(tài)性是產(chǎn)生PLT抗體的主要原因之一。

全世界每年用于治療性輸注的PLT有幾百萬單位，但隨之而來的是由此而引發(fā)的同種免疫應答等造成的輸注無效［10］。治療PLT輸注無效，應當從病因著手，采取不同的治療方案。由非免疫因素引起的輸注無效，應以治療原發(fā)病為主，如抗感染、脾切除、增加PLT輸注量來提高效果，而由免疫因素引起的，則應首先選擇PLT相容性輸注［11］，即選擇 ABO同型、HLA和 HPA交叉配型均相合的單采PLT輸注［12］，給患者輸注“合適的PLT”，取代隨機性 PLT的輸注［13］。但在實際工作中尋找三者完全相同的PLT非常困難，只有部分患者可在其親屬中找到，因此除依靠采血機構建立HLA和HPA供者分型庫提供及時、有效的輸注途徑外，臨床上使用去除白細胞的PLT、γ-輻照PLT、藥物(丙種球蛋白)等也是必不可少的治療方案。

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