Livin、Caspase-3在結腸腺癌及結腸腺瘤組織中的表達及意義

楊長命 劉洪玲 李文思 陳學軍 (遼寧醫(yī)學院病理教研室，遼寧 錦州 200)

結腸腺瘤是結腸良性腫瘤，是結腸腺癌形成的一個必然經(jīng)過，因此積極診斷和治療結腸腺瘤是減少結腸腺癌發(fā)病的重要途徑。Livin和Caspase-3是腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用的相關蛋白。本研究通過免疫組織化學染色方法和Western印跡方法檢測結腸腺癌、結腸腺瘤和結腸正常黏膜中Livin和Caspase-3的表達情況，探討其在結腸腺癌中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 隨機選取2008年1月至2012年1月我院病例完整的89例結腸腺癌手術存檔蠟塊，患者術后均經(jīng)兩位病理科醫(yī)師確診為結腸腺癌，術前均未接受化療、放療及其他治療，其中男50例，女39例，年齡28～82(平均55)歲;高-中分化65例，低分化24例;TNM 分期，Ⅰ ～Ⅱ期50例，Ⅲ～Ⅳ期39例。89例病例中有39例發(fā)生淋巴結轉移，50例無淋巴結轉移。50例結腸腺瘤手術存檔蠟塊，經(jīng)病理診斷學確診為腺瘤。癌旁5 cm以外結腸組織均未見癌組織浸潤作為正常組40例。所有組織標本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋。同時收集50例新鮮結腸腺癌、癌旁組織(距癌邊緣5 cm以內)和結腸正常黏膜組織(距癌邊緣5 cm以外)標本放入－80℃冰箱冷藏待Western印跡法檢測。

1.2 主要試劑 采用免疫組化PV-9000和Western印跡法，一抗為兔抗人Lvin單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)和兔抗人Caspase-3單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)。工作濃度1∶100，免疫組化和Western印跡所用試劑盒均由北京中衫生物有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學PV-9000兩步法 切片厚4 μm，脫蠟至水。置于3%H2O2內10 min滅活內源性過氧化物酶的活性。高壓抗原修復后，室溫自然冷卻，滴加一抗，4℃冰箱過夜;PBS液沖洗2 min 3次，滴加試劑1(聚合物輔助劑)，37℃溫箱內孵育20 min;PBS液沖洗2 min 3次，滴加試劑2(辣根酶標記羊抗鼠IgG多聚體)，37℃溫箱內孵育30 min;PBS液沖洗2 min 3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗、蘇木精復染、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。每批均設已知陽性切片作對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3.2 Western印跡方法 分別取凍存的不同結腸組織各50 mg，稱重，粉碎、低溫18 000 r/min、離心30 min、取上清液。試驗設標準管、樣品管、空白管，在波長為650 nm的條件下測定OD值。取50 μl蛋白樣品，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，90 V，1.5 h。轉膜至醋酸纖維素膜上，TBS液洗膜10 min，5%脫脂奶粉封閉過夜。TTBS洗滌2次，5 min/次，分別加入一抗，二抗，室溫孵育，加入堿性磷酸酶底物，顯色液顯色。UPV掃描儀掃描成像。

1.4 結果判定

1.4.1 免疫組化結果判定及分析方法 Livin和Caspase-3兩者均表達于細胞質，Livin也可以在細胞核表達，免疫組化陽性表達為棕黃色顆粒，且其著色強于背景非特異性染色，兩人雙盲法觀察組織切片，每例切片隨機選取5個高倍鏡視野(400倍)進行結果判定。按染色強度及陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞總數(shù)的百分比綜合計分。染色強度:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;陽性細胞數(shù):＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，＞50%為3分。染色強度得分與陽性細胞數(shù)得分相乘，0分為陰性“－”，1～3分為弱陽性“+”，4～5分為中度陽性“?”，≥6分為強陽性“?”。

1.4.2 Western印跡結果判定 Livin蛋白在33 kD處顯示特異性條帶，設分子量為42 kD β-actin為內參，Caspase-3蛋白在33 kD處顯示特異性條帶，設分子量42 kD β-actin為內參。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件，各組間率的比較采用χ2檢驗。分析Livin與Caspase-3蛋白間關系采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 Livin及Caspase-3蛋白在不同結腸組織中的表達 Livin及Caspase-3蛋白在不同結腸組織中的表達，均有顯著差異(P＜0.05)。見表1。

表1 Livin及Caspase-3蛋白在不同結腸組織中的陽性表達〔n(%)〕

2.2 結腸腺癌中Livin與Caspase-3蛋白表達與臨床病理學參數(shù)的關系 Livin蛋白在TNMⅢ～Ⅳ期和淋巴結轉移組陽性率顯著高于TNMⅠ～Ⅱ期和無淋巴結轉移組(P＜0.05);在外膜浸潤組陽性率高于肌層以內浸潤組，低分化組Livin蛋白陽性率顯著高于高-中分化腺癌組(P＜0.05)，但Livin蛋白的表達量與腫瘤大小無關(P＞0.05)。Caspase-3蛋白在TNMⅢ～Ⅳ期和淋巴結轉移組陽性率顯著低于TNMⅠ～Ⅱ期和無淋巴結轉移組;在外膜浸潤組陽性率低于肌層以內浸潤組，在低分化組Caspase-3蛋白陽性率顯著低于高-中分化腺癌組(P＜0.05)，但Caspase-3蛋白的表達量與腫瘤大小無關(P＞0.05)。見表2。

表2 結腸腺癌中Livin與Caspase-3蛋白陽性表達與臨床病理學參數(shù)的關系〔n(%)〕

2.3 Livin和Caspase-3蛋白在結腸腺癌中表達的相關性 應用Spearman相關性分析，在結腸腺癌中Livin與Caspase-3蛋白表達之間呈負相關(r=－0.219，P＜0.05)。

2.4 Western印跡結果 應用抗Livin單克隆抗體檢測，在約33 kD處出現(xiàn)特異性染色條帶;應用抗Caspase-3單克隆抗體檢測，在約33 kD處出現(xiàn)特異性染色條帶，以β-actin(42 kD)處作內參對照(圖1)。對50例結腸腺癌、癌旁、正常組織的Western印跡結果進行灰度測定和分析，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)結腸腺癌組織中Livin蛋白的表達量明顯高于癌旁及正常結腸組織(P＜0.05)，結腸腺癌組織中Caspase-3蛋白的表達量明顯低于癌旁及正常結腸組織(P＜0.05)。見表3。

圖1 各結腸組織Livin、Caspase-3 Western印跡表達情況

表3 Western印跡檢測Livin和Caspase-3蛋白在各結腸組織中的表達(s)

表3 Western印跡檢測Livin和Caspase-3蛋白在各結腸組織中的表達(s)

N1為正常組，N2為癌旁組織，N3為高分化腺癌，N4為中分化腺癌，N5 為低分化腺癌，1)與 N3、N4、N5組比較:P ＜0.05

N1 50 0.865 4±0.065 01) 0.196 7±0.023 71)N2 50 0.643 2±0.045 71) 0.287 3±0.014 61)N3 16 0.429 8±0.077 6 0.487 7±0.023 5 N4 23 0.325 8±0.075 7 0.567 7±0.058 9 N5 11 0.309 7±0.065 6 0.632 2±0.040 8

3 討論

Livin蛋白的表達具有明顯的組織選擇性，現(xiàn)已證實在很多惡性腫瘤中有Livin蛋白的過度激活及表達，其中包括黑色素瘤、淺表性膀胱癌、神經(jīng)母細胞瘤及卵巢癌等〔1～5〕。本研究提示Livin在蛋白水平上表達上調可能在促進結腸上皮細胞異常增殖和惡性轉化中起著重要作用。鄒愛民等〔6〕在12種腫瘤細胞系和50例不同腫瘤組織中檢測了Livin蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)Livin蛋白在8個細胞系中有陽性表達，本文中腫瘤組織的Livin表達均高于相應的癌旁組織，分析其與結腸腺癌臨床病理特征的關系發(fā)現(xiàn)，隨著結腸腺癌臨床分期的增加，Livin蛋白的陽性表達率及蛋白表達量亦顯著升高，而與腫瘤的直徑無關，與腫瘤的病理分級及有無淋巴結轉移有顯著關系。Yagihash等〔7〕研究證明，用熒光定量RT-PCR檢測多種消化道腫瘤細胞系，包括胰腺癌、胃癌、結腸癌以及肝癌，發(fā)現(xiàn)胃腸道腫瘤中存在Livin mRNA過表達，與人消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生存在一定關系。在胃腸道腫瘤患者的血清中抗Livin抗體也顯著升高，預示Livin可作為一種新腫瘤抗原來檢測胃腸道腫瘤。

活化的Caspase-3執(zhí)行效應Caspase的作用，非選擇性分裂水解其他蛋白、內源性核酸內切酶以及本身，激活DNA片段因子，導致DNA降解、核漿碎裂、細胞凋亡。本實驗顯示Caspase-3蛋白呈陽性表達率明顯低于正常結腸組織及癌旁組織。Livin能夠與Caspases蛋白結合發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。它特異性表達于人的胚胎組織、胎盤組織及大多數(shù)人類實體瘤細胞。此外，在正常成人組織的表達見于心臟、脾、卵巢、肺、腦、骨骼肌和淋巴細胞，但含量很低〔8〕。Kasof等〔9〕證明 Livin能夠直接抑制Caspase-3、-7、-9的酶水解作用。Livin抑制Caspases活性的作用是由BIR結構域來完成的，可能阻止Caspase蛋白在細胞凋亡時執(zhí)行蛋白切除功能。Livin的RING結構域可引起Caspase蛋白的降解，發(fā)揮其抗凋亡作用。

聯(lián)合檢測Livin和Caspase-3蛋白的表達可能作為結腸癌診斷的指標之一，同時Livin在結腸癌中過度表達，有望成為結腸癌靶向治療的一個新的分子靶點，進一步提高結腸癌臨床治療效果。Livin蛋白高表達、Caspase-3蛋白低表達與腫瘤浸潤和轉移密切相關，通過檢測Livin、Caspase-3蛋白表達情況對患者的預后作出評估。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程受諸多因素的影響，是多種基因、蛋白相互協(xié)助作用的結果，因此，結腸癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉移機制仍需進一步探討。

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6 鄒愛民，沈建軍，高 萍，等.惡性腫瘤細胞及組織中凋亡抑制蛋白livin的表達及其臨床意義〔J〕.腫瘤，2007;27(7):570-2.

7 Yagihash IA，Asanuma K，Tsuji N，et al.Detection of anti-livin-body in gastrointestinal cancer patients〔J〕.Clin Chem，2003;49(7):1206-8.

8 Ashhab Y，Alian A，Poliack A，et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological propenies and tissue distribution pattern〔J〕.FEBS Lett，2001;495(12):56-60.

9 Kasof GM，Comes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member〔J〕.Biol Chem，2001;276(5):3238-46.