多重連接依賴的探針擴增(MLPA)技術在自然流產樣本檢測中的應用

劉敏娟 段程穎 王 瑋 闞慧娟 孫 健 王 挺 李 紅 陳 瑛

(南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心 蘇州 215002)

自然流產是產科的常見病之一，導致自然流產的原因很多，國內外文獻均有報道，自然流產中胚胎染色體異常占50%左右［1］。

目前檢測染色體異常的技術有常規的染色體核型分析、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術和多重連接依賴的探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技術。核型分析是檢測染色體異常的常規方法，但其操作過程較長，組織或細胞要經過培養，若培養失敗、細胞過少或染色體形態較差時，尤其是流產的絨毛組織存在組織壞死、污染的風險較大，常常影響實驗報告的準時發放。另外核型分析難以分辨染色體的微小缺失或重復。FISH較核型分析而言大大縮短了實驗周期，并且分辨率提高至1 kb，但其一次實驗只能檢測較少的位點。

近年發展起來的MLPA具有通量高、分辨率高的特點。MLPA技術由Sehouten等［2］于2002年提出。它利用簡單的雜交、連接及PCR擴增反應，于單一反應管內可同時檢測40個不同的核苷酸序列的拷貝數變化。到目前為止廣泛應用于基因檢測及基因診斷等多個領域。由于13、18、21、X、Y染色體非整倍體發生率約占所有染色體非整倍體發生率的65%［3］，本實驗采用MLPA非整倍體篩查試劑盒，探討MLPA技術在染色體重復、缺失以及易位時的檢出能力，以評價其在自然流產組織遺傳分析中的可行性和優越性。

資料和方法

實驗材料 在患者或家屬知情同意的前提下，收集南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心經超聲檢查發現胚胎停止發育后行清宮術的絨毛組織12份。

實驗方法

核型分析 用常規絨毛細胞培養和染色體核型分析。

絨毛DNA的提取 挑取流產絨毛約15 mg，采用Qiagen試劑盒提取DNA。用ND-1000測定DNA濃度和D260/D280比值，并將DNA稀釋至25 ng/μL。

MLPA反應 本實驗采用MLPA SALSA P290-B1試劑盒，其探針混合物包含13條染色體上的51個探針:除21號染色體6個探針，13號、18號、X染色體各4個探針，Y染色體2個探針之外，還包括17號染色體8個探針，15號染色體6個探針，22號染色體5個探針，1號、7號染色體各3個探針，4號、5號、8號染色體各2個探針，依照試劑盒操作說明操作，產物用ABI3130基因分析儀進行毛細管電泳。

數據分析 用Genemarker軟件分析MLPA產物的毛細管電泳結果，并與細胞遺傳學分析結果比對。

結 果

核型分析 運用常規染色體核型分析12例流產絨毛樣本，其中1例因培養失敗未能得到核型，故只得到11例核型結果(表1)。樣本9核型分析結果為結構異常:46，XX，22q+(圖1A)，增加的片段來源不明確，懷疑為8號染色體部分片段。樣本2核型分析結果為:46，XY，－9，+15?(圖2A)，缺失一條9號染色體，增加的部分懷疑為15號染色體的部分片段。

MLPA反應 運用MLPA技術成功分析了12例流產絨毛DNA，核型分析未成功的1例樣本經MLPA分析未見異常。結合核型分析結果，在這12例樣本中共發現7例非整倍體和1例結構異常(表1)。

表1 細胞遺傳學分析與MLPA技術在流產絨毛染色體檢測中的比較Tab 1 The comparison of Karyotype and MLPA in chromosome detection of miscarriage villus

樣本9的MLPA檢測結果為:女性，8號染色體8q4．12，8q24．11 上2 個探針信號增強，2 個 22q13．33探針信號降低(圖1B、C)。提示:22號染色體增加的片段來源于8號染色體，并且22號染色體上22q13．33區段缺失。

圖1 樣本9核型分析及MLPA結果圖Fig 1 Result of Karyotype and MLPA of subject sample No．9

7例非整倍體樣本中，樣本2的MLPA檢測結果顯示:男性，15q11、15q24上4個探針信號增加，確定增加的染色體來源于15號染色體(圖2B、C)，由于MLPA非整倍體試劑盒不包括9號染色體探針，故該樣本9號染色體缺失未檢出。

圖2 樣本2核型分析及MLPA結果圖Fig 2 Result of Karyotype and MLPA of subject sample No．2

另有3例核型分析顯示12、14、16號染色體上的非整倍體，由于MLPA非整倍體試劑盒中亦不包含12、14、16號染色體上的探針，因此未檢出異常。再者，MLPA試劑盒不適用于多倍體的檢測，故1例核型分析為四倍體的樣本MLPA檢測未見異常。

討 論

孕早期胚胎染色體異常是自然流產的重要原因。有研究表明，自然流產中胚胎染色體異常占50%左右［1］。自然流產胚胎的細胞遺傳學研究發現，由于染色體數目異常所致的胚胎發育不良而造成的妊娠中斷，是自然流產最常見的原因之一［4］。受精卵細胞的正常分裂是胚胎發育過程中的關鍵環節，其中染色體分離異常，不僅可導致胚胎的染色體數目異常，而且可影響胚胎細胞的生長周期，引起細胞周期的延遲、細胞分裂的停止，甚至胚胎死亡。

在本實驗的流產絨毛染色體分析中，有66．7%(8/12)出現染色體異常，其中結構異常1例，占異常核型的12．5%;數目異常7例，占異常核型的87．5%。細胞染色體數目異常在群體中發生率約3%，在前3個月的自然流產胚胎中發生率可高達50%～60%，這種染色體數目異常的改變主要有常染色體三體、X單體和多倍體等［5］。染色體數目畸變的主要發生源自雙親之一的配子形成時或妊娠初期受精卵卵裂時出現了某號染色體不分離，則導致該染色體增多或減少一條，亦即導致三體性或單體性。21-三體在活產兒中最常見，13-三體、18-三體也偶爾可見，而其他常染色體的三體性大多導致流產，本實驗所用的MLPA P290試劑盒主要用于檢測13、18及21號染色體的微缺失或微重復。性染色體的三體性在活產女嬰中有見，性染色體的單體性不僅見于流產兒，也見于兒童或成人。多倍體在流產兒中也十分常見，本文為1例，占全部樣本的8．3%。這種染色體的數目異常可源自新的突變，或源自雙親之一配子形成中的異常有絲分裂或源自精母細胞或卵母細胞減數分裂中的異常，也可源自雙受精等。

目前，檢測染色體的非整倍性改變的基本方法為染色體核型分析，但是它在檢測羊水細胞、絨毛或其他胎兒細胞時，需要進行體外細胞培養，若培養失敗、細胞過少或染色體形態較差時，常常影響實驗結果。應用MLPA檢測這類標本時，不需要體外培養，少量標本即可進行檢測，針對易發生非整倍性改變的染色體上的幾個熱點基因設計特異性探針，根據特定基因拷貝數的改變，即可確定染色體數目的異常。

MLPA具有高度特異性，如果靶序列與探針序列不完全互補，即使只有一個堿基的差別，也會導致雜交不完全，使連接反應無法進行。只有當連接反應完成，才能進行隨后的PCR擴增并收集到相應探針的擴增峰，如果檢測的靶序列發生點突變或缺失、擴增突變，則相應探針的擴增峰便會缺失、降低或增加，因此，根據擴增峰的改變就可判斷靶序列是否有拷貝數的異常或點突變存在。

由于MLPA技術具有方便快捷、特異性高的特點，國內外均有研究將該技術作為核型分析的補充手段，用于胎兒、新生兒及流產組織的非整倍體檢測［6－8］，這些研究多采用端粒試劑盒(P036、P069 或P070)，在核型分析的基礎上大大增加了染色體異常的檢出率。考慮到流產絨毛染色體的異常多發于13、18、21、X 和 Y 染色體［8］，還包括了其他染色體的數目異常［9］和微缺失［10－11］等，為盡可能覆蓋與已知流產密切相關的染色體畸變，本實驗選擇了組合型試劑盒SALSA P290-B1，除能檢查常見的13、18、21、X和Y 5條常見染色體非整倍體情況，同時還可對常見14種染色體微缺失/微重復情況進行檢測。因為其高度的特異性，本實驗中1例結構異常樣本，細胞遺傳學分析僅能判斷出22號染色體上有一段增加的染色體片段，懷疑來源于8號染色體，但無法判斷其確切來源，且無法分析微缺失或微重復。MLPA則準確檢測出此段染色體來源于8號染色體，并檢測出22q13．33有微缺失，可能由于22q13．33區段位于22號染色體長臂末端，在8號染色體片段易位其上時丟失。另外，由于常規的染色體核型分析通過鏡下觀察，染色體片段較小時判讀困難，本實驗中1例非整倍體樣本細胞遺傳學分析結果為:46，XY，-9，+15?，懷疑增加的那條染色體來源于15號染色體，MLPA檢測結果為:男性，15q11、15q24上4個探針信號增加，證實增加的那條染色體來源于15號染色體，對核型分析結果起到了補充校正作用。

然而MLPA也有其不足之處，它僅能檢測出實驗所用探針所指示的位點，也就是說無法檢測未知位點的缺失、重復或突變。本實驗所用的 MLPA P290-B1試劑盒不包含12號、14號、16號等其他10條染色體信息，故本實驗中4例發生在9、12、14、16號染色體上的數目異常未能檢出。若能針對相應染色體的熱點基因設計特定探針便可解決這一問題。另外，由于MLPA技術是依據基因拷貝數比較來判讀結果，不適用于多倍體的檢出，故本實驗中1例92，XXYY未能檢出。

總之，作為一種新的技術，MLPA技術基于其高效、特異、快速、簡便的特點，已被運用于18-三體、21-三體、假肥大性肌營養不良、脊髓性肌萎縮癥、Dandy-Walker綜合征等多種臨床疾病的基因檢測。但同時仍存有一些不足，如需要精確測量DNA濃度，不適合檢測未知突變位點、平衡易位及多倍體。在流產樣本的染色體分析中，它能彌補傳統細胞遺傳學分析的不足，檢測微小缺失、重復或突變，且與FISH、微陣列基因組雜交等方法比較，除了具有操作簡單快捷的優點外，其經濟成本也較低，可廣泛應用于臨床，作為核型分析的重要補充，以提高染色體異常的檢出率。

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