氯吡格雷對(duì)乙酸誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍愈合的影響及機(jī)制

周海娟 顧 磊 張 玉

(1江蘇省揚(yáng)州市第三人民醫(yī)院內(nèi)科 揚(yáng)州 225000;2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年科 上海 200040)

氯吡格雷為二磷酸腺苷受體拮抗劑，具有較好的抗血小板作用。2007年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(ACC)/美國(guó)心臟學(xué)會(huì)(AHA)建議對(duì)使用阿司匹林胃腸道不能耐受的急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)患者采用氯吡格雷替代治療［1］。隨著氯吡格雷在臨床上的廣泛應(yīng)用，其相關(guān)胃黏膜損傷甚至消化道出血的報(bào)道逐漸增多，2008年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)基金會(huì)(ACCF)/美國(guó)胃腸病學(xué)會(huì)(ACG)/AHA發(fā)布的聯(lián)合專家共識(shí)對(duì)氯吡格雷替代阿司匹林也提出了質(zhì)疑［2］。研究發(fā)現(xiàn)有潰瘍病史患者服用氯吡格雷一年中再出血率達(dá)12%，而且出血部位多為既往潰瘍部位［3］，但機(jī)制尚不明確，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究較少。本研究以乙酸性大鼠胃潰瘍模型為基礎(chǔ)，觀察氯吡格雷對(duì)胃潰瘍愈合的影響，以及對(duì)潰瘍底部微血管密度(microvessel density，MVD)、胃黏膜內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A165(vascular endothelial growth factor A165，VEGF-A165)表達(dá)的影響，探討其延緩胃潰瘍愈合的機(jī)制。

材料和方法

材料 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部);氯吡格雷(杭州賽諾菲安萬(wàn)特民生制藥有限公司);CD34單克隆抗體(上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司);VEGF-A165 ELISA試劑盒及ES ELISA試劑盒(美國(guó)R＆D公司)。

方法

制模及標(biāo)本處理 將22只雄性SD大鼠運(yùn)用改良Okabe法［4］制作乙酸性胃潰瘍模型。潰瘍制作術(shù)后第3天，隨機(jī)處死6只大鼠(模型組)，解剖取胃，沿胃大彎剪開胃壁，冰生理鹽水沖洗干凈后平鋪，將潰瘍邊緣勾畫在玻璃紙上，以便用每小方格1 mm×1 mm的坐標(biāo)紙測(cè)量潰瘍面積。剩余大鼠隨機(jī)分為氯吡格雷組(10 mg/kg)和生理鹽水組，每組8只。各組分別胃內(nèi)灌注0．2%氯吡格雷或生理鹽水，1 mL/200 g體質(zhì)量，1次/天，共7天。末次給藥后禁食(不禁水)24 h，處死所有大鼠，參照上述方法測(cè)量潰瘍面積。取包括潰瘍底部和邊緣在內(nèi)的3 mm組織條，置于4%多聚甲醛溶液中，4℃固定24 h，固定后的標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫水、透明、石臘包埋切片(厚度為4 μm)，用于免疫組化染色，計(jì)數(shù)MVD。取潰瘍及潰瘍旁胃組織，稱重，加一定量生理鹽水(含50 U/mL的抑肽酶)，用勻漿器充分勻漿，離心(3 000 r/min，20 min)，取上清液，－20 ℃低溫保存，用于ELISA檢測(cè)。

MVD測(cè)定 采用CD34標(biāo)記的免疫組化染色法(SP法)。微血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)被染成棕黃色，以單個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇為一個(gè)血管標(biāo)記，管徑大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑者不計(jì)。先于低倍鏡(×100)下確定血管密度最高區(qū)，再于高倍鏡(×400)下選擇5個(gè)視野進(jìn)行微血管數(shù)目計(jì)數(shù)，取平均值，用每高倍視野(High-power field，HP)微血管數(shù)來(lái)表示 MVD［5－6］。

VEGF-A165及ES水平測(cè)定 取胃黏膜組織勻漿上清液，以紫外吸收法(280 nm)測(cè)定組織蛋白濃度，以VEGF-A165 ELISA試劑盒及ES ELISA試劑盒分別測(cè)定VEGF-A165及ES含量，結(jié)果以pg/mg蛋白表示。測(cè)試步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Stata7．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以±s差表示。多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析。兩樣本ES濃度比較采用t檢驗(yàn)，VEGF-A165濃度比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。兩變量間相關(guān)分析:ES與MVD采用Pearson相關(guān)分析，VEGF-A165與MVD采用Spearman相關(guān)分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

氯吡格雷對(duì)大鼠胃潰瘍愈合的影響 制模術(shù)后第3天潰瘍面積為(25．17±3．06)mm2。制模術(shù)后第10天，氯吡格雷組和生理鹽水組潰瘍面積分別為(11 ±3．07)mm2和(7 ±1．85)mm2，與 第3天相比均顯著縮小(P＜0．01)，但氯吡格雷組潰瘍面積是生理鹽水組的1．6倍(P=0．023 0)，說(shuō)明氯吡格雷可顯著延緩潰瘍愈合(圖1、2)。

氯吡格雷對(duì)潰瘍底部MVD的影響 制模術(shù)后第10天潰瘍底部MVD定量分析提示:氯吡格雷組MVD(6．8 ±1．8/HP)顯著低于生理鹽水組(9．9 ±2．3/HP，P=0．011 4)，可見(jiàn)氯吡格雷能夠明顯抑制潰瘍底部的微血管形成(圖3)。

氯吡格雷對(duì)胃黏膜VEGF-A165及ES表達(dá)的影響 制模術(shù)后第10天氯吡格雷組胃黏膜VEGF-A165含量顯著低于生理鹽水組(P＜0．01);ES含量顯著高于生理鹽水組(P＜0．01，表1)。

圖1 氯吡格雷對(duì)大鼠胃潰瘍愈合的影響Fig 1 Effect of clopidogrel on healing of gastric ulcers in rats

圖2 潰瘍大體標(biāo)本Fig 2 Ulcer specimens

圖3 潰瘍底部微血管CD34免疫組化染色(×100)Fig 3 Effect on MVD at the bottom of ulcers by clopidogrel(×100)

表1 氯吡格雷對(duì)VEGF-A165及ES的影響Tab 1 Effect on the expression of VEGF-A165 and ES by clopidogrel

MVD與VEGF-A165、ES的相關(guān)性 潰瘍底部MVD與胃黏膜VEGF-A165含量正相關(guān)(P=0．003 2)，與胃黏膜ES 含量負(fù)相關(guān)(P=0．000 5，表2、圖4)。

表2 MVD與VEGF-A165和ES的相關(guān)性Tab 2 The correlation between MVD and VEGF-A165 or ES

圖4 MVD與VEGF-A165、ES的散點(diǎn)圖Fig 4 The scatter diagram of MVD and VEGF-A165 or ES

討 論

本研究觀察到氯吡格雷10 mg/kg可顯著延緩乙酸性大鼠胃潰瘍愈合。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)氯吡格雷延緩胃潰瘍愈合的機(jī)制作了進(jìn)一步研究。在胃潰瘍愈合過(guò)程中，潰瘍底部肉芽組織生長(zhǎng)主要依賴血管生成過(guò)程形成新生微血管網(wǎng)，微血管形成過(guò)程受阻必然導(dǎo)致潰瘍愈合延緩［7］。現(xiàn)有資料提示［8－9］:乙酸性胃潰瘍制模術(shù)后第1～3天，是炎癥高峰期，潰瘍底部微血管數(shù)量很少，此時(shí)潰瘍局部組織內(nèi)微血管形成機(jī)制尚未全面啟動(dòng)，隨后進(jìn)入潰瘍愈合階段，微血管的形成顯著增加。為了觀察氯吡格雷對(duì)胃潰瘍底部微血管形成的影響，我們采用CD34單克隆抗體對(duì)微血管進(jìn)行了免疫組化染色。結(jié)果顯示制模術(shù)后第10天，氯吡格雷組MVD顯著低于生理鹽水組，說(shuō)明氯吡格雷可以明顯抑制潰瘍底部的微血管形成。

血管生成通常是由正負(fù)調(diào)控因子來(lái)調(diào)節(jié)的，正調(diào)控因子促進(jìn)血管形成和生長(zhǎng)，而負(fù)調(diào)控因子則起抑制作用。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生成因子之一［10］。在正常成人和動(dòng)物的多數(shù)組織中表達(dá)較少，在有新生血管生成的組織細(xì)胞中呈高表達(dá)，尤其在腫瘤組織中。VEGF-A基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄水平剪切可產(chǎn)生 5種異構(gòu)體，分別包括 121、145、165、189和 206個(gè)氨基酸。VEGF-Al65是主要的效應(yīng)分子，缺乏外顯子6編碼的產(chǎn)物，有肝素結(jié)合位點(diǎn)，既可以分泌到細(xì)胞外也可以結(jié)合在細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)，與基質(zhì)結(jié)合的VEGF-Al65經(jīng)過(guò)纖溶酶在C末端的剪切也可以釋放出來(lái)［10］，其與受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。VEGF-A主要結(jié)合在兩類酪氨酸激酶受體上，VEGFR-1(flt-1)和 VEGFR-2(KDR/flk-1)，其中 KDR起主要作用。KDR激活后引起內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、增殖和遷移，使新生血管形成和血管通透性增加。ES是最有效的內(nèi)源性血管生成抑制劑，由184個(gè)氨基酸組成，是血管周圍基底膜部位的膠原XⅧ羧基末端的一個(gè)酶解片段。成人體內(nèi)的膠原XⅧ主要在肝臟中表達(dá)，主要是由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有膠原XⅧ表達(dá)。ES作為內(nèi)源性抗血管生成物質(zhì)，可通過(guò)阻斷VEGF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，特別是微血管的內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其遷移并誘導(dǎo)凋亡，從而抑制血管生成［11－12］。

現(xiàn)有資料表明:乙酸性胃潰瘍自發(fā)愈合階段血清及潰瘍周圍黏膜組織VEGF升高、血清ES降低，潰瘍底部的微血管形成增多［5，13］。向潰瘍基底部注射質(zhì)粒編碼VEGF-A165可顯著加強(qiáng)血管生成，促進(jìn)潰瘍愈合［14］。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠胃潰瘍底部MVD與胃黏膜VEGF-A165含量正相關(guān)，與胃黏膜ES含量負(fù)相關(guān)，推測(cè)VEGF-A165及ES對(duì)大鼠胃潰瘍愈合過(guò)程中微血管生成起調(diào)節(jié)作用。制模術(shù)后第10天氯吡格雷組胃黏膜VEGF-A165含量顯著低于生理鹽水組，ES含量顯著高于生理鹽水組，MVD顯著低于生理鹽水組，提示氯吡格雷可抑制胃黏膜VEGFA165表達(dá)，同時(shí)上調(diào)胃黏膜ES水平，從而影響胃潰瘍底部的微血管生成，使胃腸道損傷黏膜難以修復(fù)，甚至發(fā)生消化道出血等嚴(yán)重并發(fā)癥。這與有潰瘍病史患者服用氯吡格雷出血率高是一致的［3］。本研究顯示:氯吡格雷對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠胃潰瘍愈合具有顯著的延緩作用，推測(cè)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)胃黏膜VEGFA165、ES的表達(dá)以抑制胃潰瘍底部的微血管形成。

［1］ Anderson JL，Adams CD，Antman EM，et al．ACC/AHA 2007 guidelines for the management of patients with unstable angina/non-ST-elevation myocardial infarction:a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines(Writing Committee to Revise the 2002 Guidelines for the Management of Patients With Unstable Angina/Non-STElevation Myocardial Infarction):developed in collaboration with the American College of Emergency Physicians，the Society for Cardiovascular Angiography and Interventions，and the Society of Thoracic Surgeons endorsed by the American Association of Cardiovascular and Pulmonary Rehabilitation and the Society for Academic Emergency Medicine［J］．Circulation，2007，116(7):e148－e304．

［2］ Bhatt DL，Scheiman J，Abraham NS，et al．ACCF/ACG/AHA 2008 expert consensus document on reducing the gastrointestinal risks of antiplatelet therapy and NSAID use:a report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on Clinical Expert Consensus Documents［J］．Circulation，2008，118(18):1894 －1909．

［3］ Ng FH，Wong SY，Chang CM，et al．High incidence of clopidogrel-associated gastrointestinal bleeding in patients with previous peptic ulcer disease［J］．Aliment Pharmacol Ther，2003，18(4):443 －449．

［4］ Okabe S，Roth'JL， Pfeiffer CJ．A method for experimental，penetrating gastric and duodenal ulcers in rats．Observations on normal healing［J］．Am J Dig Dis，1971，l6(3):277 －284．

［5］ Ma L，Elliott SN，Cirino G，et al．Platelets modulate gastric ulcer healing:role of endostatin and vascular endothelial growth factor release［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98(11):6470 －6475．

［6］ 劉大鉞，王深明，錢結(jié)勝，等．下肢靜脈性潰瘍與白細(xì)胞浸潤(rùn)和新生血管的關(guān)系［J］．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2005，22(6):678 －679．

［7］ Luo JC，Shin VN，Liu ES，et al．Dexamethasone delays ulcerhealing by inhibition ofangiogenesisin rat stomachs［J］．Eur J Pharmacol，2004，485(1 － 3):275－281．

［8］ 何美蓉，林勁秋，宋于剛．選擇性COX－2抑制劑對(duì)大鼠胃潰瘍微血管形成的影響及機(jī)制［J］．廣東醫(yī)學(xué)，2008，29(3):379 －381．

［9］ 郭津生，古永亮，王吉耀，等．結(jié)構(gòu)型與誘生型一氧化氮合酶在大鼠胃潰瘍模型中的表達(dá)和活性變化［J］．世界華人消化雜志，2001，9(3):288 －292．

［10］ Tammela T，Enholm B，Alitalo K，et al．The biology of vascular endothelial growth factors［J］．Cardiovasc Res，2005，65(3):550 － 563．

［11］ Shichiri M，Hirata Y．Antiangiogenesis signals by endostatin［J］．FASEB J，2001，15(6):1044 －1053．

［12］ Folkman J．Endogenous angiogenesis inhibitors［J］．APMIS，2004，112(7 －8):496 －507．

［13］ Amagase K，Hayashi S，Nishikawa K，et al．Impairment of gastric ulcer healing by alendronate，a nitrogen-containing bisphosphonate，in rats［J］．Dig Dis Sci，2007，52(8):1879－1889．

［14］ Jones MK，Kawanaka H，Baatar D，et al．Gene therapy for gastric ulcers with single local injection of VEGF naked DNA encoding VEGF and angiopoietin-1 ［J］．Gastroenterology，2001，121(5):1040 －1047．