20S蛋白酶體表達與類風濕關節炎的關系探討

呂曉虹 李偉 何嵐 王懷宇 蒲丹 孫怡寧 周文旭

類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis ,RA)是一種以對稱性、侵蝕性關節滑膜炎為特征的慢性、系統性自身免疫疾病, 炎癥為RA發病機制的中心環節。泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway , UPP)是真核細胞內重要的非溶酶體蛋白降解途徑, 20S蛋白酶體是UPP中具有蛋白酶催化活性的核心顆粒。UPP通過調控多種炎癥調節蛋白, 在炎癥過程中發揮著重要作用［1］。研究顯示RA患者血清蛋白酶體及其自身抗體濃度升高, 蛋白酶體抑制劑可緩解關節炎大鼠病情進展［2］, 提示蛋白酶體參與了RA的發生、發展。關節滑膜中炎癥浸潤細胞主要來源于外周血細胞［3］, 循環單核細胞在RA發病機制中具重要作用［4,5］。RA患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)是否存在蛋白酶體表達及功能異常目前尚未見報道, 本課題通過檢測RA患者20S蛋白酶體蛋白表達水平, 對該問題進行了初步探討。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 臨床確診的RA患者30例, 來自西安交通大學第一附屬醫院風濕科住院患者, RA診斷參照1987年美國風濕病協會分類診斷標準。健康對照28例, 來自西安交通大學第一附屬醫院體檢中心健康體檢人員, 排除自身免疫病性疾病。兩組研究對象均排除心、腦、肝、腎疾病；急、慢性感染；惡性腫瘤等疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 一般臨床資料 記錄所有研究對象性別、年齡, RA患者記錄病程, 檢測類風濕因子、C-反應蛋白(C-reactive protein, CRP)、紅細胞沉降率(ehythrocyte sedimention rate,ESR)、自身抗體, 計算發病時的疾病活動性評分DAS28。

1.2.2 PBMC的分離與純化 取受試者空腹外周靜脈血5 ml,加肝素鈉抗凝(3.8 μl/ml)。采用淋巴細胞分離液(上海華精)密度梯度法分離PBMC。

1.2.3 20S蛋白酶體C2亞基蛋白表達測定 采用Western印跡法測定PBMC中20S蛋白酶體C2亞基蛋白表達水平。RIPA裂解液裂解PBMC, 吸取上清液獲細胞蛋白裂解液。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳, 電轉印至NC膜。5%BSA封閉液,37℃封閉NC膜1 h。分別加入稀釋的一抗：proteasome 20S C2 Rabbit Ab (1:1000, Abcam), Rabbit Anti-β-actin(1:400, 北京博奧森), 4℃過夜。TBST洗膜5 min×3次, 加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1:8000, 北京博奧森), 37℃孵育2 h。TBST洗膜5 min×3次。等比例混合ECL發光液(Pierce Biotechnology), NC膜孵育5 min, 曝光, 凝膠成像分析系統成像保存。所得圖像導入Quantity One生物醫學圖像分析系統進行圖像分析處理, 蛋白含量以條帶的積分光密度值表示。目的條帶和內參照β-actin條帶IOD值的比值為目的片段的光密度比值, 表示檢測蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 一般臨床資料 RA患者30例(男性3例, 女性27例),年齡 (46.67±11.97)歲, 病程(6.96±3.65)年, ESR (50.55±35.02)mm/h, CRP (27.82±23.10 )mg/L, RF (90.72±74.60 )IU/ml,DAS28評分(4.89±1.60)。健康對照30例(男性5例, 女性23例), 年齡 (41.04±11.17)歲。RA與正常對照之間年齡差異無統計學意義。

2.2 20S蛋白酶體C2亞基蛋白表達 20S蛋白酶體C2亞基蛋白表達水平用Western-Blot灰度值表示(圖1)。RA患者PBMC中20S蛋白酶體C2亞基表達水平高于正常對照組［(2.92±1.41)VS (0.65±0.42), P<0.01)］差異具有顯著統計學意義。

圖1 Western-Blot檢測20S蛋白酶體C2亞基蛋白表達, 以β-Actin作為內參照

2.3 相關性分析 分別對RA患者20S蛋白酶體C2亞基表達與DAS28、CRP、ERS指標進行相關性分析, 結果顯示RA患者蛋白酶體C2亞基表達水平與DAS28、CRP、ERS之間無顯著相關性。

3 討論

UPP是真核生物細胞中一種高效的蛋白分解途徑, 具廣泛的生物學作用。蛋白酶體是依賴ATP的蛋白水解酶復合物,是真核細胞中分解內源性蛋白質的主要酶系統, 也是UPP的核心部分。蛋白酶體由20S蛋白酶體和調節顆粒組成, 主要降解一些短壽命的蛋白、變性蛋白、癌基因產物蛋白等, 對維持細胞穩態和生物學效應起到了重要作用, 也參與了免疫炎癥反應的調節［1］。

UPP與疾病關系的探討是目前研究的熱點, 其功能異常與多種人類疾病相關, 包括自身免疫病和炎癥［6］。研究發現,在系統性紅斑狼瘡(SLE)、原發性干燥綜合癥(PSS)、強直性脊柱炎(AS)、類風濕性關節炎(RA)、多發性肌炎/皮肌炎(PM/DM)等多種結締組織病中存在著蛋白酶體的異常［7,8］。上述研究主要集中在血清蛋白酶體或其抗體的檢測。

RA關節滑膜中炎癥浸潤細胞主要來源于外周血白細胞,PBMC可反映整體的炎癥狀態［9］, 而UPP通過調控多種炎癥調節蛋白在炎癥過程中發揮著重要作用。因此, 觀察RA患者PBMC中蛋白酶體的變化對于探討蛋白酶體在RA 發病機制的作用具有重要意義。本研究首次發現RA患者PBMC中20S蛋白酶體C2亞基表達水平顯著高于正常人群, 具統計學差異。該結果進一步證實了蛋白酶體與RA的發生具有密切聯系, 但其在RA發病機制中的具體作用還有待進一步研究。

隨著對UPP病理生理作用的深入研究, 蛋白酶體抑制劑的臨床應用和開發受到日益重視。蛋白酶體抑制劑bortezomib已經用于對多發性骨髓瘤的臨床治療, 并顯示了其有效性。基于蛋白酶體抑制劑強大的抗炎、抑制細胞增殖及促進凋亡的作用, 有學者提出其在RA等炎性疾病的治療中具有良好的應用前景［2,5］。體外和動物實驗證實蛋白酶體抑制劑可抑制活化的T細胞釋放炎癥因子［10］緩解關節炎大鼠的病情進展［2］, 但是否可真正應用于臨床患者還需要大量的研究。本研究為應用蛋白酶體抑制劑治療RA提供了一定的理論依據。

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