甲基紫光度法測定紅霉素腸溶片中的紅霉素

陳蓮惠，簡 易，曹洪斌

（1.川北醫學院化學教研室，四川 南充 637000；2.川北醫學院物理教研室，四川 南充 637000）

0 引 言

紅霉素屬大環內酯類抗生素，作為青霉素過敏患者的替代用藥，對很多炎癥都有很好的療效，在高濃度時對某些細菌具殺菌作用，因此在臨床上應用極廣。已報道的紅霉素分析方法有微生物檢測法[1]、高效液相色譜法（HPLC）[2-3]、電化學方法[4]、荷移分光光度法[5-7]、比濁法[8-9]等。這些方法中，有的靈敏度較低不能滿足痕量分析的要求，有的操作繁瑣、儀器昂貴、成本高。因此開發簡單、快速、靈敏的測定方法有實際意義。本文提出了利用紅霉素在近中性條件下與甲基紫反應生成締合物，用分光光度計在535nm處測定其吸光度降低值，建立了新的分光光度法測定紅霉素，可用于紅霉素腸溶片中紅霉素含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WFJ7200分光光度計（北京宏昌信科技有限公司）；PHS-4C+酸度計（成都市方舟科技開發公司）；ML104電子天平（杭州匯爾儀器設備有限公司）。

紅霉素（Erythromycin）標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號30307-200716）；甲基紫（Methyl Violet）標準品（成都科龍化工試劑廠）；紅霉素腸溶片1（吉林省長恒藥業有限公司，國藥準字H22020606）；紅霉素腸溶片2（輔仁藥業集團有限公司，國藥準字 H20073314）；冰乙酸（A.R.）（成都市科龍化工試劑廠）；磷酸（A.R.）（武漢市化學試劑廠）；硼酸（A.R.）（中國四川成都化學試劑廠）；氫氧化鈉（A.R.）（成都市科龍化工試劑廠）；無水乙醇（成都市科龍化工試劑廠）；實驗用水皆為二次石英蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑的配制

Britton-Robinson緩沖溶液：取2.47 g硼酸、2.36 mL冰乙酸和3.92g磷酸配制成1L的水溶液，與0.2mol/L的氫氧化鈉按照一定比例混合可配制一系列不同pH值的緩沖溶液，使用時用酸度計準確測定。

甲基紫溶液：準確稱取0.05g甲基紫標準品配制成250.00mL水溶液，此時濃度為5.08×10-4mol/L，使用時用水稀釋成5.08×10-5mol/L的標準工作溶液。

紅霉素貯備液：準確稱取200.4mg的紅霉素，用無水乙醇溶解、定容，配制成100.00mL的貯備液，使用時用水稀釋成0.1mg/mL的標準工作溶液。

1.2.2 實驗操作

準確移取5.00 mL紅霉素工作液于15.00 mL比色管中，加入5.00 mL甲基紫工作溶液和2.00 mL pH 6.8的B.R.緩沖溶液，用水稀釋至刻度，搖勻，室溫下靜置30 min，以試劑空白作參比，用1 cm比色皿在535nm處測定吸光度。

2 結果和討論

2.1 檢測波長的確定

按照試驗方法顯色后，在分光光度計上分別對甲基紫-紅霉素溶液、甲基紫溶液和紅霉素溶液進行掃描，結果如圖1所示。甲基紫在可見光區有強烈的吸收，最大吸收波長在584nm；而紅霉素在可見光區無明顯吸收；在pH 6.8的B.R.緩沖溶液中，甲基紫和紅霉素生成穩定的離子締合物，在可見光區吸光度較甲基紫有明顯增大，且增大最多時對應的波長在535nm附近，較甲基紫的最大吸收波長藍移了49nm；因此本文選擇測定波長為535nm。

2.2 反應條件的選擇

2.2.1 稀釋劑

試驗研究了甲醇、乙醇、水作溶劑定容時對顯色反應的影響，結果表明，用甲醇、乙醇和水作稀釋劑對試驗結果沒有明顯的影響。本實驗選用水作稀釋劑。

2.2.2 緩沖溶液種類及pH

圖1 吸收光譜（pH 6.8）

試驗了 HAc-NaAc、B.R.、Tris-HCl等緩沖溶液對試驗體系的影響，結果如圖2所示。用HAc-NaAc和Tris-HCl作緩沖介質時，緩沖范圍有限，且在可使用范圍內檢測到體系吸光度值均比B.R.緩沖溶液體系中的測定值小；當選用近中性的B.R.緩沖溶液時，反應體系的吸光度值最大。本實驗選用pH 6.8的B.R.緩沖溶液。

圖2 緩沖溶液的影響

2.2.3 顯色劑用量

按試驗方法，加入 1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00mL等不同用量的甲基紫工作液，測定吸光度，結果顯示：當顯色劑用量為5.00mL以上時，吸光度不再明顯增加。因此，本實驗選用5.00mL。

2.2.4 溫度

按試驗方法，將配制好的溶液搖勻后，置于0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100℃等不同溫度的水浴中恒溫加熱20min，冷卻到室溫，用試劑空白作參比分別測定吸光度。結果表明，室溫下反應最完全，吸光度最大。

2.2.5 顯色時間和體系穩定性

其他反應條件不變，按試驗方法，將配制好的溶液搖勻后，在室溫條件下放置 5，10，15，20，25，30，40，50，60，80，100min 后進行測定，結果顯示：反應 30min后吸光度不再有明顯的增加。其他條件不變，將配制好的溶液從30min起，相隔不同時間測定吸光度，直到誤差大于±5%。結果顯示：從最佳反應時間起，10h內吸光度差值非常小，體系穩定性好。

2.2.6 共存物質的影響

按實驗方法考察了常見8種氨基酸、維生素、糖類和無機鹽離子等共存物質對體系RRS的影響。試驗結果見表 1。較大倍數的 NH4+，Cl-、K+、Br-、K+、HCO3-等無機離子和一定量的氨基酸、糖類均不干擾，而Bi3+、Re3+、HPO42-和強力霉素等有一定干擾。加標回收試驗（表2）也顯示藥物中的輔料對測定無影響。

表1 共存物質的影響（紅霉素腸溶片溶液0.067mg·mL-1）

表2 樣品分析及加標回收實驗結果（n=6）

2.3 標準曲線和相關參數

準確移取一系列不同體積的紅霉素標準工作液于15.00 mL比色管中，按試驗方法測定吸光度，繪制標準曲線。結果表明：紅霉素的濃度在0.000 8～0.050 mg/mL范圍內服從Beer定律，有很好的線性關系。回歸方程為：A=12.336c+0.0173，r=0.9989；對15.00 mL 5.0×10-3mg/mL紅霉素連續測定6次，RSD=0.9%。方法的檢出限為0.18μg/mL（用空白加標的方法求得檢出限：將分析物紅霉素標準品配在空白溶劑中，用光度計重復測定，標準偏差的3倍所對應的濃度值為檢出限）。締合物的表觀摩爾吸光系數ε為1.63×104L/（mol/cm）。

2.4 試樣的測定

按照2010版藥典[1]，取兩個不同廠家的紅霉素腸溶片各4片，在研缽中研細，用50 mL無水乙醇，分次研磨使紅霉素腸溶片溶解，定量轉移到500 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容，搖勻，靜置。實驗時精密量取上清液適量，在最佳實驗條件下進行測定，同時采用在樣品中加入已知量的方法做回收試驗，結果見表2。由表2可知：用甲基紫作為顯色劑，用分光光度法可以測定紅霉素腸溶片中的紅霉素，用該法測得值與正規廠家生產和標示的含量基本一致；并且加標回收實驗也證明了方法可行，其穩定性和重現性均比較好。

3 結束語

在醫學院或藥物研究單位，研究簡便、快速、高效、靈敏、選擇性好的檢測高效廣譜抗生素紅霉素的方法具有非常重要的現實意義，近年來有不少的科學研究工作者都為之付出了心血和汗水。本文基于甲基紫與紅霉素的反應建立了測定紅霉素的分光光度法，該方法簡單，靈敏度較高，選擇性較好，回收率符合要求，具有一定的實用價值。

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