桂西壯族散發性激素耐藥型腎病綜合征NPHS2基因多態性分析研究

覃幼玲等

【摘要】目的探討桂西壯族散發性激素耐藥型腎病綜合征（SRNS）患者NPHS2基因突變及其特點。方法采用DNA序列直接測定法檢測50例桂西壯族散發性SRNS患兒（觀察組）血清NPHS2 基因全部外顯子及其周圍的部分內含子，并與30例健康青少年（對照組）進行比較。結果觀察組NPHS2基因的8個外顯子均未檢測到錯義突變，但檢測到 3個NPHS2 基因多態性即288C>T、954C>T和1038A>G；觀察組的基因型和等位基因頻率與對照組分別進行比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論提示NPHS2基因多態可能不是桂西壯族散發性 SRNS 患兒的主要致病原因。

【關鍵詞】NPHS2基因；激素耐藥型腎病綜合征；種族

中圖分類號：R692 文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.04.001

【Abstract】ObjectiveTo explore the mutation and characteristics of NPHS2 gene in patients with sporadic steroidresistant nephritic syndrome （SRNS） in Zhuang ethnic group in western Guangxi.MethodsDirect measurement of DNA sequence was applied to test all the exons and some surrounding introns of serum NPHS2 gene in 50 cases of children with sporadic SRNS （observation group），and then compared them with those of 30 healthy children （control group）.Results No missense mutation was found in the detection of the 8 exons of NPHS2 gene in the observation group，but 3 polymorphism of NPHS2 gene （288C>T，954C>T and 1038A>G） were found.The genotype and allele frequency of the observation group were compared with those of the control group respectively，difference was not statistically significant（P>0.05）.ConclusionThe results show that the mutation of NPHS2 gene may not be the main cause of sporadic SRNS in Zhuang ethic group in western Guangxi.

【Key words】NPHS2 gene；SRNS；ethnic group

原發性腎病綜合征（PNS）是常見的腎小球疾病，大量蛋白尿是PNS的主要臨床表現，也是腎臟病理不斷進展的主要因素之一。PNS經足量糖皮質激素治療4周無效應者稱為激素耐藥型腎病綜合征（SRNS） [1]，臨床上10%～20%的PNS患者對糖皮質激素耐藥，逐漸發展為終末期腎病（ESRD）。隨著分子生物學與遺傳學研究的深入， NPHS2基因突變可引起散發性或家族性SRNS得到證實。目前，國際上散發性SRNS患兒NPHS2基因突變的研究已有報道，我國針對散發性SRNS患兒NPHS2基因突變的研究相對較少。本研究應用直接測序技術分析桂西壯族散發性SRNS患兒NPHS2基因突變及其特點。

1對象與方法1.1研究對象選擇2011年5月～2013年5月收治于右江民族醫學院附屬醫院腎內科的50例散發性SRNS患兒（觀察組），男38例，女12例；年齡（12.13±3.68）歲。選擇尿檢正常的30 例健康桂西壯族青少年人群作為對照組，男19例，女11例；年齡（12.45±3.54）歲。本研究經醫院倫理委員會批準，知情同意書由患兒家長簽署。

1.2病例的入選和排除標準（1）發病年齡：3個月～18歲；（2）腎病綜合征：大量蛋白尿（尿蛋白>35 g/L）、低白蛋白血癥（血漿白蛋白≤30 g/L）、高脂血癥（血漿膽固醇高于 5.7 mmol/L）、不同程度的水腫；（3）激素耐藥為潑尼松1.5～2.0 mg·kg1·d1治療4周后尿蛋白未轉陰的患兒[1]；（4）籍貫為桂西地區，壯族，來自不同家族，父母非近親結婚；（5）無腎臟疾病家族史。排除標準：（1）繼發性腎病綜合征：乙型肝炎病毒相關性腎炎、系統性紅斑狼瘡、過敏性紫癜腎炎等；（2）遺傳性腎病。

1.3方法

1.3.1基因組DNA提取從外周靜脈抽取研究對象的空腹血樣5 ml，置于含有枸櫞酸鈉和EDTA抗凝試管中，應用北京天根生化科技有限公司提供的TIAN amp Blood DNA Kit（血液基因組DNA提取試劑盒），提取DNA的樣品嚴格按照操作說明書進行，確保得到高質量的DNA樣品，保存在-80℃的冰箱中備用。

1.3.2引物設計和合成從美國國立醫學圖書館的國家生物計算信息中心的 Nucleotide 數據庫獲得的基因組序列和 NPHS2基因外顯子序列（Gene Bank：NT_004487.17），應用引物設計軟件 Primer 5設計擴增NPHS2 的8個外顯子全部編碼區及其周圍的部分內含子區域，全部引物委托大連TaKaRa公司合成。NPHS2基因8個外顯子的引物序列和PCR產物見表1。

1.3.3PCR擴增NPHS2的PCR擴增反應體系為25 μl，包括2 μl 的基因組DNA，2xTaq Platinum PCR Master Mix（其中NPHS2基因的1號外顯子富含GC堿基，其為2xTaq GCrich PCR Master Mix）12.5 μl，ddH20為8.5 μl（由北京天根生化科技有限公司提供）。PCR循環條件：94℃預變性3 min后進入循環：變性94℃共30 s，退火溫度50℃～62℃（退火溫度根據各個引物的Tm值加以調整）30 s，72℃ 2 min（其中NPHS2基因的1號外顯子高GC，其為72℃1 min），共30次循環。最后72℃延伸5 min。采用2%的瓊脂糖凝膠鑒定擴增目的片段的大小。

1.3.4序列測定選擇NPHS2基因外顯子1～8號條帶顯示清晰的PCR產物，委托北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司，依據Sanger測序原理，DNA條帶測序用ABI3730自動測序儀進行直接檢測，再以Chromas軟件打開測序文件并與DNA序列峰圖對比，以峰圖為準得出每例標本的序列，使用NCBI Blast 在線軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi） 進行序列比對，當結果存在基因變異時，加測互補鏈確認基因變異，探尋NPHS2的基因突變點和單核苷酸多態性（SNPs）。

1.4統計學方法應用SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數資料用百分數或頻數表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果2.1NPHS2基因突變分析兩組均未發現NPHS2基因的錯義突變，其中19例SRNS患兒和4例健康青少年檢測到NPHS2基因的3個單核苷酸多態性（ SNPs）， 分別為288C>T（4/50），954T>C（16/50）和1038A>G（10/50）。見圖1。

2.2基因型與等位基因的頻率兩組的基因型和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義（P>005）。見表2。

改變的位置。

NPHS2突變可發生在 8 個外顯子中的任何 1 個外顯子或部分內含子，均為點突變，未發現熱點突變，可導致散發性SRNS和家族性SRNS。NPHS2基因突變大多在兒童，成人期相對較少，年齡跨度較大，從新生兒期到36歲，絕大部分對激素治療無效，免疫抑制劑療效不佳，腎移植后復發率為8%[3～4]。腎臟病理多為局灶性節段性腎小球硬化（FSGS）和腎小球微小病變型（MCD），包含8 個外顯子。

Santin 等[5]發現在 36 例SRNS患兒中有7例由NPHS1、NPHS2、CD2AP或 WT1 基因突變所致，檢出率為19.4%。18例以色列阿拉伯的散發性SRNS患兒有6例存在NPHS2基因突變（412C>T），檢出率為33.3%[6]。Lipska等[7]對德國227例青少年SRNS患者NPHS2篩查中發現有13%的染色體隱性遺傳病例和6%的散發病例存在pococin蛋白。因此，國外的研究證實進行NPHS2基因檢測已成為散發性青少年SRNS患者最合理和最有效的靶基因診斷方法之一。

國內學者Wu 等[8]率先在家族性SRNS發現了288C>T、954C>T 和1038A>G共3個SNP，隨后這些位點陸續在歐洲、亞洲部分國家的散發性SRNS 患兒中檢出。近年，虞萍等人[9]、王憲耀等[10]在中國南方漢族SRNS患兒中均未檢測出NPHS2基因錯義突變，在外顯子1，2，8中也發現以上3個SNP位點，提示NPHS2基因突變可能不是中國南方、粵東地區兒童SRNS的致病因素之一。

本研究對50例廣西桂西地區壯族SRNS患兒進行NPHS2基因變異檢測，均未發現NPHS2突變基因，但19例SRNS患兒檢測到NPHS2基因2號和8號外顯子上的3個變異，即288C>T（S96S）、954C>T（A318A）和 1038A>G（L346L），這3個變異在30例對照組中亦有檢出。同時本研究分別對兩組間的基因型頻率和等位基因頻率進行了比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。有4例SRNS患兒同時檢測到2個SNP，病理類型為MCD，這4名患兒的復發次數高于其他患兒，由于病例數較少，尚不能認定2個SNP（288C>T和1038A>G）的同時存在與SRNS患者MCD的病理類型和復發次數有相關性。

綜上所述，在50例桂西地區壯族SRNS患兒中均未檢測到NPHS2突變，但發現了 3 個NPHS2 基因多態性，提示桂西壯族散發性SRNS兒童的主要病因可能不是NPHS2 基因突變所致，檢測出的3個SNP與其發病是否相關尚待進一步研究。參考文獻[1] 中華醫學會兒科學分會腎臟病學組.兒童常見腎臟疾病診治循證指南（試行）（三）：激素耐藥型腎病綜合征診治指南[J].中華兒科雜志，2010，48（1）：7275.

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[10] 王憲耀，綦巧雯，林浩銓，等.粵東地區散發性腎病綜合征患兒 NPHS2基因多態性分析[J].分子診斷與治療雜志，2013，5（2）：107110.