化學(xué)分類(lèi)法在淡水超微型浮游植物多樣性研究中的應(yīng)用

李家園 ，侯建軍， 胡 俊 ， 史曉蕓

(1. 湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002;2. 華東師范大學(xué) 河口海岸學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200062)

0 引言

依據(jù)粒徑譜的劃分慣例[1]：粒徑在0.2～2μm的浮游植物為微微型浮游植物(picoplankton)；粒徑在2～20μm的浮游植物為微型浮游植物(nanoplankton)；另外，考慮到許多真核生物的粒徑在2～5μm之間，有人提出了用超微型浮游植物(ultraphytoplankton)來(lái)定義小于和等于5μm的浮游植物，因此超微型浮游植物包括全部的微微型浮游植物和粒徑在2～5μm的微型浮游植物。超微型浮游植物在世界范圍內(nèi)分布極廣，不同營(yíng)養(yǎng)鹽水平的湖泊中都普遍存在[2]。不論是冰雪覆蓋的極地還是熱帶亞熱帶地區(qū)，在水生態(tài)系統(tǒng)中超微型浮游植物都扮演著重要的初級(jí)生產(chǎn)者。雖然個(gè)體微小，但其生長(zhǎng)快、數(shù)量多、周轉(zhuǎn)速率快，可以維持高的生產(chǎn)力，從而成為生物地球化學(xué)循環(huán)中重要的成員；它們被一些異養(yǎng)鞭毛蟲(chóng)和纖毛蟲(chóng)攝取后，可間接成為大型浮游動(dòng)物的食物，借此進(jìn)入經(jīng)典食物網(wǎng)，最終影響漁業(yè)的產(chǎn)量。超微型浮游藻類(lèi)群落的組成和豐度是水體生態(tài)學(xué)狀況的重要指標(biāo)。

1 淡水超微型浮游植物多樣性研究現(xiàn)狀

1.1 淡水超微型浮游植物研究現(xiàn)狀

關(guān)于超微型浮游植物的研究大多集中于對(duì)海洋聚球藻、原綠球藻等微微型原核浮游植物的研究，并且關(guān)于超微型真核浮游植物的研究相對(duì)原核要滯后近10年[3]。國(guó)內(nèi)王建等[4]率先開(kāi)展了針對(duì)我國(guó)淡水水域的超微型藻類(lèi)生態(tài)學(xué)研究；此后郭贛林等[5]以及中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所的張運(yùn)林[6]分別對(duì)淡水超微型浮游植物的初級(jí)生產(chǎn)力和生物量等方面也有很好的研究。Paerl[7]于1975～1976年利用14C同位素標(biāo)記法結(jié)合掃面電子顯微鏡技術(shù)對(duì)新西蘭北島和南島共11個(gè)淡水湖泊的超微型浮游植物進(jìn)行了超微型浮游植物對(duì)總生物量的貢獻(xiàn)及其初級(jí)生產(chǎn)模式的研究，但是由于研究技術(shù)手段限制，該研究并沒(méi)有獲得其類(lèi)群組成信息；Wehr[8]對(duì)紐約Calder湖不同粒級(jí)藻類(lèi)受N、P及N/P影響差異進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)營(yíng)養(yǎng)加富實(shí)驗(yàn)的研究，結(jié)果表明超微型浮游植物能夠更有效地利用水環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在不同粒徑中的藻類(lèi)群落中具有較強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)力；Stenuite等[9]曾利用流式細(xì)胞技術(shù)和熒光顯微鏡技術(shù)對(duì)非洲東部的坦噶尼喀湖兩個(gè)不同站點(diǎn)的光合自養(yǎng)超微型浮游植物及異養(yǎng)超微型浮游植物動(dòng)力學(xué)展開(kāi)研究；Tamás等[10]于2003到2005年利用熒光顯微鏡技術(shù)和分子遺傳多樣性研究技術(shù)對(duì)中歐喀爾巴阡山脈盆地三個(gè)不同地區(qū)湖泊共十個(gè)站點(diǎn)的光合超微型浮游植物進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。因受有關(guān)研究方法的限制，相對(duì)于超微型浮游植物在淡水生態(tài)系統(tǒng)中的作用，對(duì)于其組成和豐度的研究卻沒(méi)有引起足夠的重視。

1.2 淡水超微型浮游植物生物多樣性研究方法比較

經(jīng)典的藻類(lèi)分類(lèi)方法基本是以形態(tài)學(xué)方法為主，既借助光學(xué)顯微鏡，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)樣品進(jìn)行分類(lèi)和計(jì)數(shù)。此方法在較大粒徑藻類(lèi)的分類(lèi)鑒定中一直發(fā)揮著重要作用，但也存在一些問(wèn)題[11]，比如對(duì)操作者經(jīng)驗(yàn)要求高、需要制作玻片樣本、容易損壞某些藻類(lèi)、大量樣品的檢測(cè)需要耗費(fèi)較多的人力和時(shí)間；而對(duì)于個(gè)體微小的超微型浮游藻類(lèi)卻無(wú)法用常規(guī)方法來(lái)準(zhǔn)確鑒定并計(jì)數(shù)。通過(guò)透射和掃描電鏡的方法能對(duì)超微型浮游植物形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定，但前處理較繁瑣，成本昂貴，很難應(yīng)用于大范圍、高通量樣本的檢測(cè)工作。流式細(xì)胞分析技術(shù)(Flow Cytometry, FCM)是精確計(jì)數(shù)超微型浮游植物非常有效的手段，但很難用來(lái)區(qū)別真核浮游植物的種類(lèi)組成，細(xì)胞聚集及碎屑熒光干擾也都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果；基于遺傳基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)亦不依賴(lài)于經(jīng)典的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)于DNA的提取方法要求較高，雖其靈敏度較高，但由于一些假陽(yáng)性因素的存在，使分析結(jié)果中藻類(lèi)種類(lèi)和數(shù)量偏高；原位熒光雜交技術(shù)(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)是采用與特異性序列互補(bǔ)的熒光或放射性標(biāo)記的寡核苷酸探針，協(xié)同熒光顯微技術(shù)或流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)鑒定各種分類(lèi)水平上復(fù)雜樣品中的遺傳多樣性的分析技術(shù)，因此實(shí)驗(yàn)操作繁瑣耗時(shí)，工作量大，而且不能保證樣品中的藻類(lèi)達(dá)到100%的雜交；相比較之下，化學(xué)分類(lèi)法有無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)。

1.3 色素化學(xué)分類(lèi)法研究淡水超微型浮游植物生物多樣性的優(yōu)勢(shì)

生物體的化學(xué)成分是化學(xué)分類(lèi)法的依據(jù)和基礎(chǔ)。諸如脂肪酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、色素等，而光合色素以其在浮游藻類(lèi)種群分布的特異性引起研究者的關(guān)注。依據(jù)光合色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可將其分為三類(lèi)：葉綠素類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)、藻膽蛋白類(lèi)。從功能上可將類(lèi)胡蘿卜素分為光合色素和光保護(hù)色素，光合類(lèi)胡蘿卜素(PSC)通常包括以下幾種：巖藻黃素、青綠藻黃素、19'-己酰基氧化巖藻黃素、19'-丁酰基氧化巖藻黃素、多甲藻素、和α-胡蘿卜素；光保護(hù)類(lèi)胡蘿卜素(PPC)主要包括硅甲藻黃素、別藻黃素、硅藻黃素、甲藻黃素、葉黃素、新黃素、玉米黃素和β-胡蘿卜素 。特征色素在不同類(lèi)群中的分布不同[12]，并且只存在于特定浮游植物類(lèi)群中，如甲藻中的多甲藻素，青綠藻中的青綠藻黃素，藍(lán)藻和綠藻中的玉米黃素，定鞭金藻中的19'-己酰基氧化巖藻黃素等。隨著高效液相色譜(HPLC)技術(shù)的發(fā)展，利用反相高效液相色譜分析藻類(lèi)的色素組成，以總?cè)~綠素a的量代表總生物量，特征色素與葉綠素a的比值通過(guò)一定的數(shù)學(xué)運(yùn)算可以指示特定的浮游藻類(lèi)對(duì)浮游植物總生物量的貢獻(xiàn)，進(jìn)而確定某種種群的豐度和組成。基于HPLC色素分析的化學(xué)分類(lèi)法以其操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高、效率高、可進(jìn)行大規(guī)模和高通量分析的優(yōu)點(diǎn)而受到廣大研究者的青睞。利用HPLC能夠很好地對(duì)色素進(jìn)行分析，對(duì)藻類(lèi)的種類(lèi)和粒徑?jīng)]有限制。這對(duì)于超微型浮游植物的豐度組成研究將具有重要的意義。此方法在海洋浮游藻豐度和組成的研究中應(yīng)用較廣，國(guó)內(nèi)外對(duì)淡水藻的相關(guān)研究也開(kāi)始逐步重視。

2 色素化學(xué)分類(lèi)法研究淡水浮游植物生物多樣性的應(yīng)用

2.1 色素化學(xué)分類(lèi)法配套算法論證分析

浮游植物的化學(xué)計(jì)算方法有多元線(xiàn)性回歸法、迭代法、矩陣因子法，這三種方法受特征色素與葉綠素a的初始比值影響較大，而這個(gè)比值又與光照及營(yíng)養(yǎng)鹽水平所引起的藻類(lèi)細(xì)胞生理學(xué)狀況密切相關(guān)，CHEMTAX的產(chǎn)生較好地解決了這一難題，它采用多次運(yùn)算的方式，減少其對(duì)初始色素比值的依賴(lài)，使結(jié)果向"真實(shí)值"收斂，從而提高結(jié)果的準(zhǔn)確性[13]。

Mackey等[14]對(duì)CHEMTAX程序進(jìn)行了評(píng)估，他們通過(guò)對(duì)色素比例及初步計(jì)算數(shù)據(jù)導(dǎo)入隨機(jī)性錯(cuò)誤，來(lái)模擬HPLC分析中由于色素濃度的誤差而導(dǎo)致的特征色素與葉綠素a比值誤差以及在HPLC操作分析過(guò)程中產(chǎn)生的誤差，結(jié)果顯示，此程序很成功地用于浮游植物豐度及組成分析，值得注意的是，在缺少特征色素二乙烯基葉綠素a、二乙烯基葉綠素b的情況下依然可以檢測(cè)到原綠球藻，而用傳統(tǒng)方法卻無(wú)法檢測(cè)到原綠球藻，這一點(diǎn)無(wú)疑十分重要。Latasa[13]用8個(gè)特征色素比值的原始矩陣，對(duì)已知特征色素比值40個(gè)樣品的色素濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行多次了運(yùn)行來(lái)驗(yàn)證CHEMTAX對(duì)原始色素比值分析的靈敏度及其對(duì)浮游植物類(lèi)群分析的有效性，雖然計(jì)算結(jié)果與真實(shí)值有些出入，但隨著運(yùn)算次數(shù)的增加，結(jié)果可以向真實(shí)值靠攏。Guisande等[15]對(duì)廣布于亞馬遜、安第斯山、加勒比等不同區(qū)域湖泊、池塘、沼澤十六個(gè)站點(diǎn)的樣品進(jìn)行色素分析，并結(jié)合CHEMTAX程序運(yùn)算來(lái)評(píng)估樣品中淡水藻類(lèi)的豐度及組成，結(jié)果顯示，除了玉米黃素與葉綠素a的比值外，大部分藻類(lèi)的特征色素與葉綠素a的比值基本不隨水環(huán)境及季節(jié)的差異而變化，實(shí)驗(yàn)得出的平均特征色素比例矩陣并結(jié)合CHEMTAX計(jì)算，可對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)鹽狀況下淡水環(huán)境中藻類(lèi)種群的豐度和組成進(jìn)行評(píng)估。

2.2 色素化學(xué)分類(lèi)法研究淡水浮游植物生物多樣性的案例分析

Andersen等[16]曾對(duì)超微型浮游藻類(lèi)樣品分別進(jìn)行HPLC色素分析、掃面電子顯微鏡和熒光顯微鏡的觀察。研究發(fā)現(xiàn)在上層水域中，掃描電子顯微鏡鏡檢結(jié)果和HPLC分析結(jié)果一致，但是隨深度增加，分析結(jié)果相似度下降，這可能是由于深度變化引起的藻類(lèi)細(xì)胞內(nèi)色素含量變化導(dǎo)致特征色素與葉綠素a的比值變化引起的，因此HPLC方法可以用于藻類(lèi)豐度、組成的研究。另外，F(xiàn)ietz等[17]將淡水浮游植物的色素?cái)?shù)據(jù)分別用多元線(xiàn)性回歸法和CHEMTAX進(jìn)行計(jì)算。此兩種方法在主要藻類(lèi)組成上并無(wú)顯著性差異。作為重要研究成果之一，他還從樣品中發(fā)現(xiàn)并分離出了一種紫黃素含量極高的超微型隱藻(Eustigmatophyceae)。Descy等[18]應(yīng)用HPLC-CHEMTAX對(duì)坦噶尼喀湖中的藻類(lèi)豐度進(jìn)行了為期兩年的監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)藻類(lèi)種群、豐度組成隨空間變化差異很大。同樣，為驗(yàn)證HPLC-CHEMTAX是否能夠用來(lái)鑒定淡水浮游藻類(lèi)的類(lèi)群豐度和組成，Schluter等[19]在不同光照強(qiáng)度條件下培養(yǎng)了20種具有代表性的淡水單種藻，并用來(lái)研究藻類(lèi)色素與類(lèi)群組成和豐度的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除玉米黃素/葉綠素a和別藻黃素/葉綠素a的比值外，其他特征色素與葉綠素a的比值均不受光照的影響，通過(guò)CHEMTAX計(jì)算出來(lái)的藻類(lèi)生物量與光學(xué)顯微鏡鏡檢結(jié)果一致，并且CHEMTAX還能檢測(cè)到一些光學(xué)顯微鏡沒(méi)有觀察到的藻類(lèi)。

國(guó)內(nèi)相關(guān)研究方面，劉紅和謝平等[20]利用HPLC對(duì)武漢東湖淡水水域的光合色素進(jìn)行了分離分析，結(jié)果表明可以通過(guò)定量光合輔助色素來(lái)精確描述湖泊優(yōu)勢(shì)浮游植物的生物量，其和相應(yīng)標(biāo)志色素之間的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.96.侯燕松等[21]等通過(guò)HPLC分析了淡水中常見(jiàn)藻類(lèi)的主要相關(guān)色素，表明其均可作為分類(lèi)的依據(jù)，并通過(guò)具體的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該方法，顯示其應(yīng)用于淡水藻類(lèi)的分類(lèi)鑒定是可行的。

3 色素化學(xué)分類(lèi)法應(yīng)用于淡水超微型浮游植物研究的問(wèn)題及展望

化學(xué)分類(lèi)法操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高、可進(jìn)行大規(guī)模和高通量分析，并且HPLC能夠準(zhǔn)確地對(duì)色素進(jìn)行分離分析，對(duì)藻類(lèi)種類(lèi)和粒徑?jīng)]有限制。隨著HPLC分析技術(shù)不斷發(fā)展，越來(lái)越多的藻類(lèi)色素被發(fā)現(xiàn)，鑒于此，需要繼續(xù)改善分離分析條件，優(yōu)化色素的分離方法和穩(wěn)定保存方法，建立一種更加完善的色素分離分析方法，從而使各研究之間的結(jié)果更具可比性。

在淡水藻類(lèi)尤其是超微型藻類(lèi)的組成和豐度研究中，一方面，由于淡水區(qū)域浮游植物的種類(lèi)組成與海洋中有很大差別，其特征色素與葉綠素a的比值肯定存在較大差異。而CHEMTAX軟件所附帶的特征色素與葉綠素a的比值矩陣源于海水藻類(lèi)，這一數(shù)據(jù)直接被套用到淡水領(lǐng)域的合理性仍需進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)慎重使用。因此，獲得淡水浮游植物各類(lèi)群的特征色素與葉綠素a的比值矩陣是開(kāi)展淡水浮游植物化學(xué)分類(lèi)法工作首當(dāng)其沖的任務(wù)。另一方面，由于浮游植物特征色素與葉綠素a的比值受環(huán)境光照及營(yíng)養(yǎng)條件的影響較大，開(kāi)展淡水超微型浮游植物的室內(nèi)生態(tài)實(shí)驗(yàn)，獲得各類(lèi)群浮游植物在不同生長(zhǎng)周期、光照條件、營(yíng)養(yǎng)條件下的特征色素與葉綠素a的比值變化情況，對(duì)于不同環(huán)境條件下的現(xiàn)場(chǎng)數(shù)據(jù)分析具有重要的指導(dǎo)意義。當(dāng)然，超微型浮游植物難以單獨(dú)培養(yǎng)，因此獲得以上數(shù)據(jù)較為困難，我們可以通過(guò)對(duì)現(xiàn)場(chǎng)樣品的超微型藻類(lèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室混合培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選后獲得單一藻類(lèi)，并進(jìn)行色素組成及含量的分析，以期獲得各類(lèi)群特征色素與葉綠素a的比值范圍，進(jìn)而對(duì)CHEMTAX的計(jì)算過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，并嘗試將其推廣至超微型浮游植物的類(lèi)群分析及豐度檢測(cè)中，使其能可靠地應(yīng)用于淡水超微型浮游植物生物多樣性研究。另外，由于一種特征色素可能分布在幾種不同的藻類(lèi)，如巖藻黃素在硅藻、金藻、定鞭金藻中都有分布，雖然可以通過(guò)不同藻類(lèi)中它與葉綠素a的比值不同來(lái)進(jìn)行快速、高通量的定量分析，但要實(shí)現(xiàn)對(duì)藻類(lèi)的精確鑒定和分類(lèi)，還需將熒光顯微鏡分析或流式細(xì)胞技術(shù)及分子生物技術(shù)結(jié)合起來(lái)使用。

總之，利用化學(xué)分類(lèi)法能有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)超微型浮游藻類(lèi)的豐度和組成進(jìn)行快速和大量研究。將這些結(jié)果與環(huán)境理化因子等數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)研究目標(biāo)水域超微型浮游植物的豐度、組成、多樣性及其與環(huán)境因子的互動(dòng)關(guān)系進(jìn)行研究，從而弄清楚一些超微型浮游植物的分布成因及與地理環(huán)境關(guān)系、演替規(guī)律和生態(tài)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，并進(jìn)一步深化我們對(duì)超微型浮游植物這一特定生物類(lèi)群生態(tài)功能及其在生物地化循環(huán)中作用的認(rèn)識(shí)。

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